秦鍇 賀長林 劉峰

（都江堰市人民醫(yī)院 四川都江堰 611830）

臨床流行病學(xué)資料顯示，早期可手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者預(yù)后較好，但仍有部分患者術(shù)后發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此，術(shù)前探尋早期結(jié)直腸癌患者微轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物及如何降低患者術(shù)前微轉(zhuǎn)移的發(fā)生成為了研究熱點［1］。本研究采用實時熒光定量PCR的方法檢測結(jié)直腸癌患者術(shù)前外周血CK20mRNA的水平并判斷術(shù)前口服希羅達(dá)是否對患者外周血CK20mRNA的相對含量產(chǎn)生影響，從而推測術(shù)前口服希羅達(dá)化療是否能降低患者術(shù)后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)風(fēng)險［2］。

1 資料與方法

1.1 一般資料 四川都江堰市人民醫(yī)院2011年10月至2013年10月收治的結(jié)直腸癌患者75例，隨機分為試驗組38例和對照組37例。試驗組男23例，女15例，平均年齡（45.5±10.6）歲，術(shù)后病理類型：中高分化腺癌13例，中分化15例，低分化10例；對照組男20例，女17例，年齡（42.3±11.1歲），術(shù)后病理類型高分化15例，中分化14例，低分化8例。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理兩組患者的年齡、性別、腫瘤分期等差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），組間具有可比性。

1.2 儀器試劑

1.2.1 儀器 ABI PRISM7000real－time PCR 反應(yīng)儀（購自美國ABI公司）；恒溫水浴鍋（購自美國GRANT公司）；普通離心機（購自美國Beckman公司。

1.2.2 試劑材料 RNA提取試劑盒（購自TAGENG公司）；CK20mRNA熒光定量PCR試劑盒（上海久盛醫(yī)療用品有限公司）。CK20mRNA上游引物：5′－CAGGCACACGGT－GAACTATGG－3′，下 游： 5′－GATCAGCTTCCACTGTTAGCG－3′。cDNA反轉(zhuǎn)錄采用oligoDT方法對全基因組mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成Cdna，所有引物序列由TAKARA大連寶生物有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 給藥方法 試驗組術(shù)前每天希羅達(dá)2500 mg／m2，兩次口服，共1周，對照組為進(jìn)行術(shù)前輔助化療。于患者術(shù)晨抽取外周靜脈血10mL進(jìn)行檢測血漿循環(huán)采CK20mRNA。

1.3.2 RNA提取劑real－time PCR 根據(jù)全基組RNA提取試劑盒操作說明，提取兩組患者外周血總RNA，然后根據(jù)TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并檢測cDNA濃度。根據(jù)real－timePCR熒光定量試劑盒操作說明，對上述兩組患者cDNA中的CK20mRNA進(jìn)行檢測，并根據(jù)熒光強度判斷CK20mRNA相對含量及陽性率（圖1）。

圖1 CK20mRN實時熒光定量PCR擴(kuò)增及溶解曲線

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 SPSS15.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2或fisher確切概率法比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者外周CK20mRNA陽性率比較 試驗組38例患者希羅達(dá)口服1周后外周血CK20mRNA檢測陽性21例（55%），對照組CK20mRNA檢測陽性35例（95%），試驗組CK20mRNA陽性率顯著低于對照組（P＜0.05）。

2.2 兩組陽性患者CK20mRNA相對含量比較試驗組CK20mRNA陽性患者其CK20mRNA相對換量為0.13±0.08，顯著低于對照組0.78±0.22（P＜0.05）圖2。

圖2 兩組患者CK20mRNA相對含量比較

3 討 論

結(jié)直腸癌是我國常見消化道腫瘤，臨床上較為常見，早期接受手術(shù)治療患者預(yù)后較好，但晚期發(fā)生轉(zhuǎn)移患者預(yù)后較差，5年生存率較低［3］。但臨床流行病學(xué)資料顯示，部分早期患者術(shù)后仍然發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此提示臨床分期為早期的結(jié)直腸癌患者在進(jìn)行手術(shù)時可能已經(jīng)發(fā)生了微轉(zhuǎn)移［4、5］。術(shù)前或術(shù)中發(fā)生微轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者術(shù)后預(yù)后不良的重要原因之一。因此，術(shù)前探尋早期結(jié)直腸癌患者微轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物成為了研究熱點。CK源于上皮細(xì)胞，包括至少20種相關(guān)基因多肽家族，是上皮細(xì)胞分化的標(biāo)記物，臨床研究顯示，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)直腸癌患者血清CK20的水平顯著升高，被認(rèn)為是檢測癌細(xì)胞循環(huán)的敏感標(biāo)記物。CK20是一種新發(fā)現(xiàn)的多肽，局限在胃腸上皮細(xì)胞具有嚴(yán)格組織特異性，幾乎在所有大腸癌中都明顯表達(dá)。我們推測，用編碼CK20蛋白的CK20mRNA作為CK20蛋白的上游表達(dá)產(chǎn)物，應(yīng)與CK20在預(yù)測結(jié)直腸癌微轉(zhuǎn)移方面具有同樣效果，且其為CK20的編碼基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，應(yīng)在判斷的敏感性和特異性方面更優(yōu)于 CK20［6，5］。因此，本研究采用real－timePCR的方法對我院收治的75例早期接受手術(shù)的結(jié)直腸癌患者進(jìn)外周血CK20mRNA水平檢測，并根據(jù)是否術(shù)前應(yīng)用希羅達(dá)口服化療分為試驗組和對照組，判斷希羅達(dá)術(shù)前口服化療對患者外周血CK20mRNA表達(dá)水平的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗組CK20mRNA陽性率顯著低于對照組（P＜0.05）；試驗組 CK20mRNA 陽性患者其CK20mRNA相含量顯著低于對照組（P＜0.05）。結(jié)果提示，結(jié)直腸癌患者術(shù)前口服希羅達(dá)可顯著降低患者外周血CK20mRNA陽性率及拷貝數(shù)。

本研究中采用術(shù)前希羅達(dá)口服化療，降低了患者外周血CK20mRNA的表達(dá)水平，因而可能在一定程度上減低患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險，但由該研究部分?jǐn)?shù)據(jù)尚未獲得，無法對兩組患者術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及生存率進(jìn)行完整統(tǒng)計，因而希羅達(dá)術(shù)前口服化療是否降低腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險及延長患者生存時間有待進(jìn)一步研究。

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［3］張健.希羅達(dá)與奧沙利鉑治療中晚期結(jié)腸癌的療效分析與評價［J］.臨床合理用藥雜志，2011，04（36）：53.

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