宋現(xiàn)青 何振華 蔡彬 廖凱 張森△

（1廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科 廣西南寧 530021；2賀州市人民醫(yī)院普通外科 廣西賀州 542800）

膿毒癥是嚴重感染引起的有潛在致死風險的全身性炎癥反應綜合癥（SystemicInflammatoryResponse Syndrome，SIRS）［1］。在美國，膿毒癥的年發(fā)生率大約為千分之三［2］，其中重癥膿毒癥（Severe sepsis）年死亡人數(shù)大約20萬例。盲腸結(jié)扎穿孔（Cecal Ligation and Puncture，CLP）模型是膿毒癥實驗研究中的“金標準”［3］，但是在CLP模型建立過程中，多種因素影響到動物模型的穩(wěn)定性，而關(guān)于嚴重程度的影響因素研究尚少。本研究通過析因方差分析方法探索盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）膿毒癥大鼠模型嚴重程度的影響因素，以期為后續(xù)深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與分組 Wistar大鼠，雄性，清潔級，出生后7～12周，體重250～300g。購于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。合格證號：SCXK桂2009－0005。廣西醫(yī)科大學動物倫理委員會核準實驗方案，實驗動物采用office軟件包Excel表格隨機數(shù)字編號。選取的影響因素及水平分別為：盲腸結(jié)扎比例25%、50%、75%；抗生素使用情況包括使用、未使用；穿刺針型號為12號和16號，按3×2×2水平，建立12個膿毒癥組，具體分組為：A組：盲腸結(jié)扎比例25%＋12號穿刺針頭＋術(shù)后予以抗生素；B組：盲腸結(jié)扎比例25%＋12號穿刺針頭＋術(shù)后不予以抗生素；C組：盲腸結(jié)扎比例25%＋16號穿刺針頭＋術(shù)后予以抗生素；D組：盲腸結(jié)扎比例25%＋16號穿刺針頭＋術(shù)后不予以抗生素；E組：盲腸結(jié)扎比例50%＋12號穿刺針頭＋術(shù)后予以抗生素；F組：盲腸結(jié)扎比例50%＋12號穿刺針頭＋術(shù)后不予以抗生素；G組：盲腸結(jié)扎比例50%＋16號穿刺針頭＋術(shù)后予以抗生素；H組：盲腸結(jié)扎比例50%＋16號穿刺針頭＋術(shù)后不予以抗生素；I組：盲腸結(jié)扎比例75%＋12號穿刺針頭＋術(shù)后予以抗生素；J組：盲腸結(jié)扎比例75%＋12號穿刺針頭＋術(shù)后不予以抗生素；K組：盲腸結(jié)扎比例75%＋16號穿刺針頭＋術(shù)后予以抗生素；L組：盲腸結(jié)扎比例75%＋16號穿刺針頭＋術(shù)后不予以抗生素，另外建立正常對照組和假手術(shù)組，共分14組，每組6只。同時按相同分組方案建立膿毒癥大鼠生存觀察組，每組24只，觀察大鼠生長情況至72h，記錄大鼠一般表現(xiàn)及死亡情況。

1.2 CLP模型建立 制作過程參照 Wen，H［4］等以及Cuenca，A.G等［5］的操作流程。主要為：術(shù)前8h禁食，自由飲水；10%水合氯醛0.35mL／100g體積質(zhì)量比腹腔麻醉至適宜狀態(tài)，備皮、消毒、鋪巾，于腹白線處作1.5～2.0cm切口，分離腹肌及腹膜至腹腔，取出盲腸，手術(shù)絲線確定相應結(jié)扎比例，盲腸結(jié)扎，相應穿刺針貫穿結(jié)扎盲腸一次，擠壓盲腸使腸內(nèi)容物溢出，回納盲腸，關(guān)腹；其中抗生素組術(shù)畢予以頭孢曲松鈉25mg／kg每12h皮下注射，未使用組以等量生理鹽水做對照。假手術(shù)組未行盲腸結(jié)扎及穿刺針穿孔處理，其余操作參照CLP模型組。正常對照組無額外處理。

1.3 大鼠模型取材檢測 ①實驗組大鼠建模24h后，麻醉放血處死大鼠，主動脈溫生理鹽水灌注后，切取約1.0g肝右副葉組織－80℃凍存；②取出凍存肝臟組織，冰面融化，PBS溶液洗滌2次，吸干水分，液氮條件下研至粉末狀，轉(zhuǎn)移至離心管中，記錄粉末質(zhì)量。③冰面條件下，加入100mg／1mL RIPA裂解液及1mM的pmsf液，旋渦震蕩靜置30 min后，4℃條件下14000r／m離心10分鐘，微量移液器上清至另一滅菌EP管中保存；③取適量組織蛋白提取液用BCA法檢測總蛋白濃度；剩余組織蛋白提取液使用懸液芯片技術(shù)定量檢測IL－1α、TNF－α、IL－6表達水平。

1.4 統(tǒng)計分析 方法所有計量數(shù)據(jù)資料采用均數(shù)±標準差（）表示，統(tǒng)計方法采用t檢驗、單因素方差分析和析因方差分析，生存時間曲線分析使用Log－rank檢驗，檢驗統(tǒng)計量P＜0.05為有顯著統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計學分析采用SPSS 21.0軟件包進行。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠術(shù)后一般情況 CLP模型大鼠12h后開始出現(xiàn)明顯細菌感染征象，主要有豎毛、蜷縮、少動、精神倦怠、少食、體重減輕、呼吸急促，膿尿、腹瀉、眼角滲出物等。假手術(shù)組及正常組未見明顯異常表現(xiàn)。24h后存活大鼠解剖腹腔內(nèi)可見血性滲液，盲腸腫脹、粘連，嚴重的發(fā)生壞疽，色澤暗紅或發(fā)黑。

2.2 各膿毒癥大鼠生存率變化 模型組術(shù)后72h觀察期內(nèi)，假手術(shù)組大鼠死亡數(shù)為0。CLP模型組術(shù)后12h開始出現(xiàn)死亡且死亡高峰主要出現(xiàn)在24～48h內(nèi)。CLP模型組的生存率均低于假手術(shù)組（P＜0.05）。隨著盲腸結(jié)扎比例增加，大鼠的生存率逐漸降低，經(jīng)log－rank檢驗比較差異有統(tǒng)計學意義（A、E和I組；B、F和J組；C、G和 K組；D、H 和L組分別比較）（P＜0.05）。12號和16號穿刺針頭亞組大鼠生存率比較未表現(xiàn)顯著統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但12號穿刺針頭組的生存率均值低于16號組。比較頭孢曲松鈉使用情況對CLP膿毒癥模型大鼠的生存率影響發(fā)現(xiàn)，術(shù)后予以抗生素組的大鼠生存率高于未予抗生素者（除了E／F，K／L組生存率相同外），但兩者相較無顯著統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

表1 各組不同時間點的大鼠死亡數(shù)

2.3 細胞因子表達析因方差分析結(jié)果 統(tǒng)計結(jié)果分析顯示大鼠肝臟組織IL－1α、TNF－α、IL－6在膿毒癥組的表達水平均高于正常組和假手術(shù)組（P＜0.05）（見表2），析因方差分析結(jié)果顯示：固定因子盲腸結(jié)扎比例對IL－1α、TNF－α、IL－6的表達水平的作用具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而頭孢曲松鈉使用情況與盲腸結(jié)扎比例在IL－1α、TNF－α、IL－6的表達水平具有交互作用（P＜0.05）（見表3）。

表2 各膿毒癥組細胞因子表達水平均值差（Sham組－膿毒癥組）（pg／mg）（n＝84）

表3 wistar大鼠CLP膿毒癥模型嚴重程度影響因素析因方差分析結(jié)果

3 討 論

CLP模型動物在膿毒癥的研究中得到廣泛的應用，但是如何控制模型嚴重程度以得到滿足不同研究目的膿毒癥模型仍然是個難題。

根據(jù)本實驗分組析因方差分析統(tǒng)計結(jié)果顯示，盲腸結(jié)扎比例與CLP大鼠膿毒癥嚴重程度存在相關(guān)性，即盲腸結(jié)扎比例越大，膿毒癥病情越重，且更嚴重膿毒癥的細胞因子水平變化速度快于較輕微的膿毒癥，細胞因子的變化與膿毒癥嚴重程度表現(xiàn)為非直線相關(guān)關(guān)系，盲腸結(jié)扎長度是膿毒癥嚴重程度的獨立決定因素，該結(jié)論與 Singleton KD 等［6～8］報告相似，盲腸末端的結(jié)扎提供了壞死組織源作為感染灶促進膿毒癥進展，這點在臨床膿毒癥患者尤其是嚴重組織創(chuàng)傷者中經(jīng)常見到［9］。結(jié)扎的比例越長則壞死感染組織越多，并且擠出的腸內(nèi)容物量也隨結(jié)扎比例的增加而逐漸增大，同時伴隨死亡率的增加。

在動物模型中，由于動物的個體化差異，動物在對疾病的反應方面有很大的變異，因此嚴格控制盲腸結(jié)扎比例對復制可重復性的膿毒癥模型至關(guān)重要。我們的研究結(jié)果表明盲腸結(jié)扎比例決定了膿毒癥的進展速度以及病情嚴重程度，嚴格利用盲腸結(jié)扎比例條件可以獲得研究周期內(nèi)生存率0～100%膿毒癥模型動物。模型死亡率的調(diào)整可隨不同的實驗研究目而不同；此外盲腸結(jié)扎比例的標準化可以簡化膿毒癥誘導的程序，從而使后續(xù)研究者更易掌握，但具體相關(guān)機制尚未明確。我們認為IL－1α、IL－6、TNFα表達水平上升協(xié)同壞死組織及病原菌持續(xù)釋放入血的綜合作用可能在整個過程中起到關(guān)鍵作用。

實驗結(jié)果表明盲腸結(jié)扎比例與頭孢曲松鈉使用情況在細胞因子表達水平的交互作用表現(xiàn)為顯著統(tǒng)計學差異（P＜0.05），但是章德文等的研究認為膿毒癥期間抗感染治療未影響膿毒癥預后轉(zhuǎn)歸。

相應機理［10］可能為頭孢曲松鈉與病原菌表面青霉素結(jié)合蛋白（Penicillin Binding Proteins，PBPs）共價結(jié)合從而抑制PBPs酶活性，進而菌體胞壁肽聚糖合成受抑，最終胞壁缺損，菌體裂解，但是同時細菌碎片被釋放，如LPS或脂蛋白（Lipoprotein，LP），從而加劇膿毒癥期間的抗炎級聯(lián)反應。也因如此，針對膿毒癥的治療方案現(xiàn)在更多地傾向于早期液體復蘇及使用針對細胞因子的抗體或抑制物療法［11］。

此外不同穿刺針型號對IL－1α、IL－6、TNFα細胞因子的表達水平的主效應統(tǒng)計量P值均大于0.05，沒有顯著統(tǒng)計學差異，即12號和16號穿刺針造成的細胞因子表達量的總體均數(shù)相同，從而表明穿刺針型號與膿毒癥嚴重程度沒有顯著性統(tǒng)計學相關(guān)關(guān)系，該結(jié)論與前期文獻報告不同［5，12］。理論上講，結(jié)扎盲腸穿刺針的大小決定了盲腸內(nèi)容物流向腹腔中的量，該指標同膿毒癥的嚴重程度密切相關(guān)［13］?？赡艿脑蚴撬褂么┐提樦睆降牟町愡^小，從而使由穿刺針直徑大小不同造成的腹腔腸內(nèi)容物的量的差異不顯著從而導致膿毒癥大鼠細胞因子表達水平?jīng)]有顯著性改變，因此CLP模型的制作仍然需要進一步地完善。此外更深入的研究應該進行以探尋兩者間的關(guān)聯(lián)。

總之，盲腸結(jié)扎比例是決定CLP模型死亡率和炎癥反應程度的重要決定因素，CLP模型的缺陷在于難于精確控制流入腹腔腸內(nèi)容物的量或體積，并且致感染病灶易被網(wǎng)膜或周圍組織包裹局限，無法達到膿毒癥標準，從而影響后續(xù)分析研究。而通過引入不同穿刺針型號及抗生素使用情況等多種因素以完善CLP膿毒癥模型的穩(wěn)定性和標準化研究，更有利于CLP模型貼近于臨床實際。

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