張秋爽，張國珍*，李大波，張國財

(1.東北林業(yè)大學，哈爾濱150040；2.紅花爾基林業(yè)局)

在植物生存環(huán)境受到諸如干旱、溫度、病蟲害、土壤pH、金屬的脅迫時，就會產生大量活性氧，活性氧量與抗氧化系統(tǒng)間的平衡就會被打破，對植物造成損傷[1]。在環(huán)境脅迫初期，植物體內的抗氧化物質上升，自身會產生一定的保護性反應，酶促防御系統(tǒng)和非酶促防御系統(tǒng)就會發(fā)揮作用[2]。植物體內通過SOD、CAT和POD同工酶的相互協調配合，可清除過剩的自由基，使體內自由基維持正常的動態(tài)平衡，提高植物抗逆性。SOD的主要功能是特異性的催化超氧陰離子的歧化反應，對防止活性氧對機體的傷害及防御機體衰老有十分重要的作用[3]。在植物中存在Cu·Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三種。測定SOD的方法有NBT光化還原法、超氧化鉀直接測定法、鄰苯三酚自氧化法和黃嘌呤氧化酶法等[4]。

本試驗采用黃嘌呤氧化酶法，對遭受棘梢斑螟[5]危害的樟子松球果中的SOD活性進行測定，以確定最佳測定條件。

1 試驗材料

1.1 球果：采自內蒙古紅花爾基林業(yè)局林場，按危害程度不同，分成4個等級，健康的為0級，表面有輕微取食痕跡的為1級，中度危害(表面能看到兩個取食孔)為2級，重度危害(表面有3個或3個以上取食孔，球果表面產生變色現象)為3級。

1.2 試劑：磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、冰醋酸、考馬斯亮藍G-250、95%乙醇、85% H3PO4、標準牛血清蛋白、氯化鈉、雙蒸水、碳酸鈣、石英砂、SOD測試盒(南京建成)。

1.3 儀器設備：研缽、離心機、分析天平、電熱恒溫水浴鍋、移液器、1cm光徑比色皿、紫外分光光度儀。

2 試驗方法

2.1 試驗流程

2.1.1 相同危害等級的球果樣品混在一起，準確稱取樟子松球果2g，加入8mL 0.1mL/L pH=7.2的磷酸鹽緩沖液，加少量碳酸鈣和石英砂，冰浴下研磨成勻漿，制備成20%的勻漿液，3500～4000r/min離心10min，取上清液待測。

2.1.2 按下表加入試劑，應用液要現用現配。

表1 SOD活性測定流程 mL

混勻，室溫放置10min后，于波長550nm處，1cm光徑比色皿，用雙蒸水調零，進行比色。

2.2 最佳取樣量確定

由于酶的百分抑制率與酶的活力呈拋物線關系，抑制率在15%～55%基本為正比關系，因此最佳取樣量應控制在15%～55%，以45%左右為最佳。

抑制率R=(對照OD值—測定OD值)/對照OD值

2.3 顯色時間對SOD活力的影響

有時由于實驗量等因素的影響，導致不能及時測定樣品的吸光度，故設計不同顯色時間。在混勻后，分別于室溫放置10、15、20min測定吸光度，用SPSS17.0軟件進行差異顯著性分析。

2.4 試驗的可重復性

取10個健康球果樣品進行3平行試驗，計算變異系數。

2.5 總SOD活力計算

2.5.1 根據組織濕重進行換算

以每克組織在1mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個SOD活力單位(U)。

注：R為抑制率；V1為反應液總體積(mL)；V2為取樣量(mL);勻漿液濃度(g/mL)C1=(組織濕重(g))/(勻漿介質體積(mL))

2.5.2 根據蛋白濃度進行換算

蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法。以每毫克組織蛋白在1mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為1個SOD活力單位(U)。

注：R為抑制率；V1為反應液總體積(mL)；V2為取樣量(mL)；C2為待測樣本蛋白濃度(mgprot/mL)；mgprot為毫克蛋白數。

3 試驗結果

3.1 最佳取樣量確定

表2 不同取樣量下SOD抑制率

因此，取樣量定為80μL。

3.2 顯色時間對SOD活力的影響

顯色10、15、20min所測OD值，進行單因素ANOVA分析，P值為0.859>0.05，差異不顯著，因此顯色時間對SOD活力影響不大。

3.3 可重復性

測定結果，吸光度OD=0.337±0.007，P值為0.336，樣品間差異不顯著；變異系數CV為(1.19±0.11)%，可見該方法可重復性良好。

3.4 用不同方法計算總SOD活力

3.4.1 組織濕重法

圖1 組織濕重法SOD總活力趨勢圖

用組織濕重法表示總SOD活力，隨危害等級的增加，總SOD活力呈現先上升后下降的趨勢，危害等級為2級時總SOD活力最高，3級時雖有所下降但仍高于0級。顯著性檢驗時，P值為0.000，說明不同危害等級的球果SOD活力差異極其顯著。

3.4.2 用蛋白濃度表示總SOD活力

蛋白濃度標準曲線y=.0069x，R2=0.999

表3 不同危害等級的球果中蛋白濃度

圖2 蛋白濃度法SOD總活力趨勢圖

用蛋白濃度法表示SOD總活力，結果與組織濕重法基本一致，可以排除蛋白質的存在對測定結果的干擾。顯著性檢驗，P值為0.000，說明不同危害等級的球果SOD活力差異極其顯著。

4 結論

樟子松是我國固沙造林地區(qū)重要的造林樹種之一，具有耐瘠、耐旱、防風、固沙特點[6]。在遭受棘梢斑螟危害后，樟子松球果SOD活性發(fā)生顯著變化。結果表明，隨危害等級的增加，總SOD活力呈現先上升后下降的趨勢，危害等級為2級時總SOD活力最高，為108.51U/mg prot，危害等級為3級時總SOD活力82.36 U/mg prot，雖有所下降但仍高于0級的74.74 U/mg prot，說明樟子松在逆境(蟲害)條件下，發(fā)生明顯的防御反應，來降低自身的損傷。采用黃嘌呤氧化酶法[7]測定樟子松球果總SOD活力，應用液與顯色劑需現配現用，最佳取樣量為80μl，此時SOD抑制率為46.5%，線性關系最佳，測定效果好，該方法顯色穩(wěn)定，可重復性強，適用于樟子松球果總SOD活力測定。研究結果可為樹種抗性選優(yōu)提供理論依據，在害蟲綜合治理中，利用植物本身的抗蟲性是重要的策略[8]。

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