黃柳，楊蓉，李擁軍，劉素云，張輝

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，河北石家莊050000）

倍他樂克聯(lián)合右美托咪啶對(duì)心肌缺血再灌注大鼠NADPH氧化酶亞基-細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)的機(jī)制研究

黃柳，楊蓉Δ，李擁軍，劉素云，張輝

（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，河北石家莊050000）

目的探討倍他樂克聯(lián)合右美托咪啶對(duì)心肌缺血再灌注大鼠煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase，NADPH oxidase）亞基、單核細(xì)胞趨化因子-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）水平及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響。方法SD大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組（sham operation group，SO）、缺血再灌注組（ischemic perfusion group，IP）、NADPH氧化酶抑制劑apocynin治療組（apocynin treatment group，AT）及倍他樂克聯(lián)合右美托咪定組（metoprolol combined dexmedetomidine group，MD）。采用大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎方法建立大鼠心肌缺血再灌注模型。Real-time PCR及Western blot方法分析各組大鼠血漿和心肌組織中NADPH亞基、MCP-1、MMP-2、MMP-9以及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白—半胱氨酸天冬氨酸蛋白-3（cysteine aspartic acid proteinase-3，Caspase-3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白-9（cysteine aspartic acid proteinase-9，Caspase-9）的表達(dá)變化。結(jié)果與SO組相比，IP組大鼠血漿和心肌組織的NADPH氧化酶亞基、MCP-1、MMP-2及MMP-9的表達(dá)均顯著增高（P＜0.01），同時(shí)細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)也顯著增高（P＜0.01），而AT組和MD組可部分恢復(fù)上述蛋白的異常表達(dá)。結(jié)論倍他樂克聯(lián)合右美托咪定通過抑制心肌組織中NADPH氧化酶的過渡激活介導(dǎo)的MCP-1上調(diào)表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)緩解缺血再灌注引起的大鼠心肌損傷。

倍他樂克；右美托咪定；缺血再灌注大鼠心肌損傷；單核細(xì)胞趨化因子-1；基質(zhì)金屬蛋白酶；細(xì)胞外基質(zhì)降解與重構(gòu)

心肌缺血再灌注損傷即在一定條件下缺血心肌恢復(fù)血液再灌注后，缺血性損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象［1］。缺血再灌注不僅不能恢復(fù)組織及器官的正常功能，反而能夠加重其結(jié)構(gòu)異常和功能損傷。單核細(xì)胞趨化因子-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）與機(jī)體的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，是引起單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞發(fā)生浸潤的重要趨化因子［2-3］。細(xì)胞外基質(zhì)降解和重構(gòu)是心肌組織結(jié)構(gòu)及功能異常的重要基質(zhì)，主要有基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）所介導(dǎo)［4-5］。基質(zhì)金屬蛋白酶活性增強(qiáng)，誘發(fā)心肌組織細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生降解與重構(gòu)，影響心肌的正常收縮、舒張功能［6-7］。已有的研究證實(shí)，多種組織中氧化應(yīng)激與細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)及炎癥反應(yīng)具有相關(guān)性［8-9］。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase，NADPH oxidase）即NADPH氧化酶是多亞基酶類，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)氧自由基增多，細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡。過多的反應(yīng)氧自由基引起細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能異常及促凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白-3（cysteine aspartic acid proteinase-3，Caspase-3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白-9（cysteine aspartic acid proteinase-9，Caspase-9）等的過表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究旨在探討倍他樂克聯(lián)合右美托咪啶對(duì)心肌缺血再灌注大鼠NADPH亞基、MCP-1、MMP和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平的影響，為相關(guān)研究及臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 40只清潔級(jí)成年SD大鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SZXK（上）20080033，雌雄不拘，體質(zhì)量（220±10）g；所有實(shí)驗(yàn)操作遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.2 試劑 Apocynin、倍他樂克及右美托咪定均購自美國Sigma Aldrich公司；ELISA試劑盒購自美國B＆D公司；MCP-1、MMP-2、MMP-9、Caspase-3和Caspase-9均購自Santa Cruz公司；p22phox、p47phox亞基抗體購自Abcam公司；二抗及顯色試劑盒購自武漢博士德公司。脫脂奶粉購自內(nèi)蒙古伊利乳業(yè)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠／羊抗兔的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；mRNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；SYBR Premix Ex Taq購自大連寶生物工程有限公司。

1.3 儀器 ABI7700熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；引物合成購自上海生工生物有限公司；PVDF膜購自美國Amersham公司；電泳槽、電泳儀及蛋白轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購自美國ABI公司。

1.4 心肌缺血再灌注大鼠模型的建立 所有動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲食。SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只：SO組、IP組、AT組及MD組。研究采用大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎方法建立大鼠心肌缺血再灌注模型：結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支前30min從右腔靜脈注射生理鹽水，結(jié)扎30min后松開并再行灌注120min。SO組僅穿線但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。AT組（10mg／kg）和MD組（5mg／kg＋5mg／kg）于結(jié)扎前30min于右腔靜脈注射。造模結(jié)束后逐層縫合肌肉、皮膚，大鼠手術(shù)切口處注射少許青霉素注射液，并用碘伏擦拭消毒，防止感染。

1.5 ELISA分析血漿中MCP-1及MMP2 大鼠處死前頸動(dòng)脈放血處死動(dòng)物并用內(nèi)壁涂有肝素鈉的離心管收集血液，立即離心（3000 r／min，10 min）并4℃保存。ELISA檢測MCP-1及MMP-9水平均采用試劑盒，所有操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.6 Real-time PCR mRNA提取及逆轉(zhuǎn)錄過程均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。Real-time PCR反應(yīng)條件：95℃熱啟動(dòng)10 min；94℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，72℃收集熒光，共37個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為20μL：cDNA 2μL；Forward Primer（10 μM）0.5μL；Reverse Primer（10μM）0.5μL；2.5×SYBR Green（TianGen）8μL；蒸餾水9μL。

表1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time PCR assay

1.7 Western blot 心肌組織在冰水浴中用裂解液充分裂解，采用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)蛋白定量后以等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和半干法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)至PVDF膜上后1%BSA室溫條件下封閉2 h。然后與一抗4℃溫孵12 h，PBS漂洗3次后與二抗室溫反應(yīng)4 h。PVDF膜用PBS漂洗后用ECL混合液顯色、曝光、顯影、定影，用凝膠成像分析系統(tǒng)測定光密度，以β-actin作為參照，進(jìn)行蛋白表達(dá)的定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)數(shù)據(jù)以“±s”表示，組間采用t檢驗(yàn)，以P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺血再灌注大鼠血漿MCP-1及MMP-9水平的變化與SO組相比，IP組大鼠的MCP-1、MMP-9水平均顯著增高（P＜0.01）；與IP組相比，AT組和MD組的上述指標(biāo)顯著降低（P＜0.01，見表2）。

表2 缺血再灌注大鼠血漿MCP-1及MMP-9水平的變化Tab.2 Change of MCP-1and MMP-9 in ischemic reperfusion rats

2.2 缺血再灌注大鼠心肌組織NADPH氧化酶亞基表達(dá)變化 與SO組相比，IP組大鼠的心肌組織NADPH氧化酶亞基p22phox及p47phox蛋白的表達(dá)水平均顯著增高（P＜0.01）；與IP組相比，AT組和MD組的上述指標(biāo)顯著降低（P＜0.01，見圖1）。

圖1 缺血再灌注心肌組織NADPH氧化酶亞基表達(dá)變化Fig.1 Expressions of NADPH oxidase subunits in ischemic reperfusion heart in rats**P＜0.01，與SO組相比，compared with SO group；＃＃P＜0.01，與IP組相比，compared with IP group

2.3 缺血再灌注大鼠心肌組織MCP-1表達(dá)的變化 與SO組相比，IP組大鼠的心肌組織MCP-1蛋白的表達(dá)水平均顯著增高（P＜0.01）；與IP組相比，AT組和MD組MCP-1顯著降低（P＜0.01，見圖2）。

圖2 缺血再灌注心肌組織MCP-1表達(dá)變化Fig.2 Expression of MCP-1 in ischemic reperfusion heart in rats**P＜0.01，與SO組相比，compared with SO group；＃＃P＜0.01，與IP組相比，compared with IP group

2.4 缺血再灌注心肌組織MMP-2和MMP-9表達(dá)的變化與SO組相比，IP組大鼠的心肌組織MMP-2、MMP-9的mRNA及蛋白的表達(dá)水平均顯著增高（P＜0.01）；與IP組相比，AT組和MD組的上述指標(biāo)顯著降低（P＜0.01，見圖3）。

圖3 缺血再灌注心肌組織MMP-2及MMP-9表達(dá)變化Fig.3 Expression of MMP-2 and MMP-9 in ischemic reperfusion heart inmRNA and protein level in rats**P＜0.01，與SO組相比，compared with SO group；＃＃P＜0.01，與IP組相比，compared with IP group

2.5 缺血再灌注心肌組織Caspase-3及Caspase-9表達(dá)的變化 與SO組相比，IP組大鼠的心肌組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cpasase-3及Caspase-9蛋白的表達(dá)均顯著增高（P＜0.01），且NADPH氧化酶抑制劑AT組和MD組上調(diào)上述凋亡蛋白的異常表達(dá)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，見圖4）。

圖4 缺血再灌注心肌組織Caspase-3及Caspase-9蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of Caspase-3 and Caspase-9 in ischemic reperfusion heart in rats**P＜0.01，SO組相比，compared with SO group；＃＃P＜0.01，與IP組相比，compared with IP group

3 討論

缺血再灌注損傷即心肌在較短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生供血中斷，并在一定時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血液供應(yīng)而發(fā)生的比供血前損傷更嚴(yán)重的現(xiàn)象。缺血再灌注可以導(dǎo)致幾乎臨床上所有類型的心肌組織的結(jié)構(gòu)和功能異常。高濃度的氧自由基可以導(dǎo)致細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的失衡，進(jìn)而損傷心肌細(xì)胞［10］。已有的證據(jù)顯示氧化應(yīng)激在缺血再灌注損傷中具有廣泛的參與作用［1，6］。本研究通過大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎方法建立大鼠心肌缺血再灌注模型研究倍他樂克聯(lián)合右美托咪啶對(duì)心肌缺血再灌注大鼠NADPH亞基、MCP-1、MMP水平和細(xì)胞凋亡蛋白的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與SO組相比，IP組大鼠血漿和心肌組織的NADPH氧化酶亞基、MCP-1、MMP-2及MMP-9的表達(dá)均顯著增高，同時(shí)細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)也顯著增高。而apocynin和倍他樂克聯(lián)合右美托咪定可部分恢復(fù)上述蛋白的異常表達(dá)。因此，倍他樂克聯(lián)合右美托咪定通過抑制NADPH氧化酶的過渡激活介導(dǎo)的MCP-1及MMP上調(diào)表達(dá)緩解缺血再灌注引起的大鼠心肌損傷。

研究表明倍他樂克通過抑制炎癥反應(yīng)減輕心肌膠原沉積，發(fā)揮改善心肌梗死后膠原重構(gòu)的作用［11］。右美托咪定臨床上多用于全身麻醉手術(shù)患者氣管插管及機(jī)械通氣時(shí)鎮(zhèn)靜。研究證實(shí)右美托咪定在缺血再灌注腦損傷緩解方面具有顯著的作用，且右美托咪定確實(shí)能減輕腦缺血后超微結(jié)構(gòu)的損傷［12］。同時(shí)，右美托咪定也可以通過減少缺血再灌注后炎癥因子的生成降低血漿中的I-FABP濃度發(fā)揮對(duì)缺血再灌注腸道損傷的保護(hù)作用［13］。本文中發(fā)現(xiàn)倍他樂克聯(lián)合右美托咪定可以顯著恢復(fù)大鼠血漿和心肌組織的NADPH氧化酶亞基、MCP-1、MMP-2及MMP-9的表達(dá)均明顯增高，同時(shí)對(duì)異常增高的細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)也具有明顯的抑制作用，提示2者聯(lián)合使用可能是通過抑制NADPH氧化酶介導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用，進(jìn)一步抑制單細(xì)胞趨化因子活性增強(qiáng)以及細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)發(fā)揮治療缺血再灌注的作用。

細(xì)胞外基質(zhì)降解和重構(gòu)是心肌損傷的重要機(jī)制，可以嚴(yán)重影響正常心肌的結(jié)構(gòu)與功能。以往研究也證實(shí)，大鼠腦在缺血再灌注后MMP-2和MMP-9均表現(xiàn)為明顯的升高趨勢，MMP-2的異常表達(dá)與缺血再灌注的水腫形成有關(guān)［14］。另外，在研究大鼠局灶性缺血／再灌注模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)能對(duì)血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用［15］。在本研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎方法建立大鼠心肌缺血再灌注模型中血漿MMP-9水平及心肌組織MMP-2和MMP-9的表達(dá)均明顯增高，提示該模型大鼠心肌組織中存在細(xì)胞外基質(zhì)降解與重構(gòu)。而NADPH氧化酶抑制劑Apocynin可以抑制異常表達(dá)的MMPs，表明缺血再灌注損傷可能是由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)參與的。這與以往的研究基本一致［16-17］。

因此，倍他樂克聯(lián)合右美托咪定通過抑制NADPH氧化酶的過渡激活介導(dǎo)的MCP-1上調(diào)表及心肌組織細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)緩解缺血再灌注引起的大鼠心肌損傷。

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（編校：王冬梅，譚玲）

Effect ofmetoprolol combined dexmedetom ide on NADPH oxidase subunit and extracellular matrix rexombination in ischem ic reperfusion rats

HUANG Liu，YANG RongΔ，LIYong-Jun，LIU Su-Yun，ZHANG Hui

（Cardiology，The Second Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050000，China）

ObjectiveTo investigate the effect ofmetoprolol combined dexmedetomide on NADPH oxidase subunit，MCP-1，MMP and apoptosis related protein in ischemic reperfusion rats.MethodsSD ratswere divided into 4 groups：sham operation group（SO），ischemic perfusion group（IP），apocynin treatment group（AT）and metoprolol combined dexmedetomide group（MD）.Myocardial ischemia-reperfusion injunymodel was established by ligation of left anterior descending coronary artery（LAD）method.The expression of NAPDH，MCP-1，MMP-2 and MMP-9 were detected by Western blot or Real-time PCR.The apoptosis related protein Caspase-3 and Caspase-9 were also assayed in each group.ResultsThe expression of NADPH oxidease subunit，MCP-1，MMP-2，MMP-9 was increased greatly in IP group when compared with SO group（P＜0.01），as well as apoptosis related protein Caspase-3 and Caspase-9 were up-regulated dramatically in IP group when compared with SO group（P＜0.01），while AT group and MD group could recover these parameters greatly.ConclusionMetoprolol combined dexmedetomide alleviates ischemic perfusion injurymediated by theway of increasing MCP-1 expression by inhibiting activated NADPH oxidase in heart and inhibiting extracellularmatrix recombination.

metoprolol；dexmedetomidine；ischemic perfusion heart injury；MCP-1；MMP；extracellularmatrix recombination

R966

A

1005－1678（2014）09－0042－04

河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃基金項(xiàng)目（20110084）

黃柳，男，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：心血管內(nèi)科學(xué)，E-mail：huangliu90＠163.com；楊蓉，通信作者，女，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：冠心病、心衰、高脂血癥的診治，E-mail：yangr877＠163.com。