全碧波 張善鋒 李月白 李曉坤 李嘯然 李 潔

(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，河南 鄭州 450001)

骨肉瘤是骨組織最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，約占所有骨腫瘤的20%。典型的惡性骨肉瘤具有顯著地局部侵襲性和早期遷徙能力〔1〕，由于其轉(zhuǎn)移病癥較難診斷，通常該病患死亡率較高。過氧化物酶體增殖因子活化受體(PPAR)γ的激動劑能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡或分化，其作為人類癌癥的化學(xué)預(yù)防劑的潛在用途是目前研究的熱點〔2〕。本研究分析PPARγ激動劑15-脫氧前列素2(15d-PGJ2)對人骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討其抗腫瘤的作用機制。

1 材料和方法

1.1材料 人骨肉瘤細(xì)胞株MG63(北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)；15d-PGJ2(美國Cayman公司)；胎牛血清(PAA公司)；胰蛋白酶(美國Gibco公司)；MTT、DMSO(美國Sigma公司)； RPMI 1640培養(yǎng)液(北京索萊寶科技有限公司)；DEPC(加拿大Fermentas公司)；AnnexinV-FITC試劑盒(南京凱基公司)；PCR擴增試劑盒 (加拿大Fermentas公司)；SP法免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)細(xì)胞復(fù)蘇、換液和傳代，倒置相差顯微鏡觀察骨肉瘤MG63細(xì)胞的生長情況及形態(tài)學(xué)特征，取生長狀態(tài)良好的骨肉瘤細(xì)胞描記細(xì)胞生長曲線。

1.3實驗分組 以人骨肉瘤MG63細(xì)胞為作用對象，分為：對照組，不添加任何藥物；15d-PGJ2組，根據(jù)實驗加入其終濃度分別為0.1、1、5、10、20、50 μmol/L的15d-PGJ2。

1.4MTT法檢測細(xì)胞增殖活力 取對數(shù)生長期MG63細(xì)胞，以3×104/ml細(xì)胞濃度，接種96孔培養(yǎng)板，每孔200 μl，細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，加入不同濃度的15d-PGJ2，對照組不加藥，每組設(shè)6個復(fù)孔，空白對照組加入等量溶劑。分別孵育24 h、48 h、72 h及96 h，每孔加入MTT液20 μl(5 g/L)，4 h后棄去上清液，并加入DMSO 150 μl，終止反應(yīng)。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測吸光度(A值)，并以空白對照孔的A值調(diào)零。生長抑制率(E)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。重復(fù)3次。

1.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 取對數(shù)生長期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以2×105/ml的濃度接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，次日貼壁后加入終濃度分別為0.1、1、5、10、50 μmol/L的15d-PGJ2。培養(yǎng)48 h和72 h，收集2×106個細(xì)胞，70%冰乙醇固定，4 ℃冰箱過夜，次日檢測并對樣本進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.6AnnexinV/PI雙染色檢測細(xì)胞凋亡 將20 μmol/L 15d-PGJ2干預(yù)48 h的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)取1×106個細(xì)胞置離心管內(nèi)，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入1 ml PBS緩沖液，重復(fù)上述操作。再加入500 μl的上樣緩沖液，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，依次加入10 μl AnnexinV-FITC，5 μl碘化丙啶(PI)輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min。隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.7逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測藥物干48 h PPARγ mRNA的表達(dá) 利用TRIzol法提取總RNA，嚴(yán)格按照RT-PCR試劑盒說明操作，分別以不同引物擴增PPARγ和內(nèi)參照β-actin。各引物序列如下：β-actin上游，5'-AAG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3'；下游，5'-AGA AGG CTG GGG CTC ATT G-3'，擴增片段為176 bp；PPARγ上游，5'-CAG GAG CAG AGC AAA GA-3';下游，5'-GGA CTC AGG GTG GTT CA-3'，擴增片段為474 bp。PCR擴增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，35次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以待測基因與相應(yīng)內(nèi)參照條帶面積灰度值比值作為mRNA相對表達(dá)量。

1.8免疫細(xì)胞化學(xué)檢測相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá) 采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(SP法)染色試劑盒，工作濃度為1∶200，按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS15.0進(jìn)行方差分析和t檢驗，組間兩兩比較用Student-Newan-Keuls檢驗。

2 結(jié) 果

2.1生長曲線描記 培養(yǎng)過程中，骨肉瘤MG63細(xì)胞生長較為迅速，傳代后短期內(nèi)處于潛伏適應(yīng)期，隨后便進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)胞數(shù)目顯著增多，達(dá)到平臺期后，生長穩(wěn)定，細(xì)胞分裂增殖速度逐漸變慢，最后直至衰老，細(xì)胞數(shù)目明顯減少。

2.2不同時間濃度的15d-PGJ2干預(yù)MG63細(xì)胞增殖的結(jié)果 同一濃度的15d-PGJ2對MG63細(xì)胞的生長抑制作用24 h與48 h比較有差異(P<0.01)，48 h、72 h及96 h時間范圍內(nèi)隨著時間的延長其抑制率并無差異(P>0.05)。在各個時間點，任兩個濃度組兩兩比較的均有差異(P<0.05)，相同時間點的抑制率從0.1 μmol/L至50 μmol/L隨著藥物濃度的遞增而增加。其中在50 μmol/L濃度的抑制率幾乎達(dá)到100%(表1)。15d-PGJ2藥物對MG63的半數(shù)抑制率IC50為3.599 μmol/L。

表1 各濃度15d-PGJ2在不同時間對人骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖的抑制率

2.315d-PGJ2干預(yù)人骨肉瘤MG63細(xì)胞周期的結(jié)果 ①不同濃度水平的各細(xì)胞周期分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。在48 h和72 h時間點，G0/G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例在5 μmol/L和20 μmol/L 15d-PGJ2兩個濃度組間均有差異(P<0.05)；在兩個時間點均顯示為用藥組G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于對照組，S和G2/M期細(xì)胞比例明顯低于對照組，且隨藥物濃度的增加，G0/G1期比例有上升的趨勢；即藥物可使細(xì)胞周期G0/G1期阻滯。②不同時間點無差異(P>0.05)。見表2。

2.4AnnexinV/PI雙染色檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果 5 μmol/L 和20 μmol/L 15d-PGJ干預(yù)48 h，凋亡率分別為18.32%和32.08%，與對照組凋亡率(1.15%)比較差異顯著(P<0.05)。

2.5RT-PCR檢測藥物干預(yù)48 h PPARγ mRNA表達(dá)的結(jié)果 對照組和20 μmol/L 15d-PGJ2濃度組電泳條帶與相應(yīng)的內(nèi)參β-actin灰度值的比值分別為0.94±0.23和2.06±0.35，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

1：對照組；2：15d-PGJ2處理組；M:Marker

2.6免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測藥物干預(yù)后相關(guān)凋亡基因蛋白表達(dá)的結(jié)果 20 μmol/L 15d-PGJ2干預(yù)MG-63細(xì)胞48 h，加藥組caspase-3和Bax蛋白表達(dá)的陽性率(分別為126.46±3.83和135.36±6.72)明顯增高于對照組(86.46±3.73和97.08±3.84)(P<0.05)；而加藥組P53和bcl-2蛋白表達(dá)陽性率(分別為135.06±2.73，126.17±3.54)明顯低于對照組(163.29±4.67和181.34±5.76)(P<0.05)。

表2 各濃度15d-PGJ2作用48 h和72 h時人骨肉瘤MG63的細(xì)胞周期分布

3 討 論

PPARs是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，靶基因的轉(zhuǎn)錄激活依賴于配體與受體的結(jié)合〔3〕。其中15d-PGJ2是PPARγ的內(nèi)源性天然配體，與該受體具有特異的親和作用。近期研究表明，PPARγ在乳癌、前列腺癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞中都有表達(dá)，并且配體激活的PPARγ有抑制細(xì)胞增殖，誘發(fā)凋亡信號，誘導(dǎo)分化以及抗血管生成的作用〔4～6〕。本實驗采用結(jié)果表明，15d-PGJ2可使MG63細(xì)胞阻滯于G1期，抑制細(xì)胞DNA的合成，使S期細(xì)胞減少，阻止細(xì)胞進(jìn)入M期，經(jīng)有絲分裂而產(chǎn)生的子代細(xì)胞數(shù)減少，這與細(xì)胞增殖實驗的結(jié)果一致。本實驗結(jié)果顯示，一定范圍濃度的15d-PGJ2可誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡，且具有明顯藥物濃度依賴性。本研究發(fā)現(xiàn)，15d-PGJ2可使PPARγ mRNA表達(dá)量明顯升高，同時凋亡相關(guān)基因caspase-3和Bax表達(dá)上調(diào)，由對照組不同程度的陰性或弱陽性變?yōu)殛栃员磉_(dá)，而P53和bcl-2基因的表達(dá)下調(diào)，由對照組陽性表達(dá)轉(zhuǎn)為弱陽性或陰性表達(dá)。由此推測15d-PGJ2誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡可能與激活其受體PPARγ，誘導(dǎo)bcl-2/Bax比例的變化以及促進(jìn)caspase-3的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑有關(guān)。野生型P53可能通過上調(diào)Bax的表達(dá)誘導(dǎo)bcl-2/Bax比例的變化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。綜上所述PPARγ的激動劑15d-PGJ2能夠通過抑制MG-63細(xì)胞的生長與增殖，通過細(xì)胞周期滯止與促凋亡進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤作用。人骨肉瘤MG-63細(xì)胞中PPARγ的高表達(dá)可能為骨肉瘤的預(yù)防與治療提供新的治療靶點。

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