楊 玉 商 宇 陳玨曉 徐 鵬 盧曉瀟 孫志博 張 麗 邵文武 張鵬霞

(佳木斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

齊墩果酸(OA)是中藥女貞子的主要成分。研究表明，OA具有誘導(dǎo)人白血病原髓細(xì)胞株(HL-60)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的作用〔1～3〕，但是其誘導(dǎo)凋亡的機制尚不完全清楚。本實驗檢測線粒體凋亡信號通路關(guān)鍵蛋白半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-9、Smac/DIABLO、細(xì)胞色素C(Cyt-c)和凋亡誘導(dǎo)蛋白(Bid)表達(dá)，研究其對線粒體凋亡信號通路的干預(yù)作用，探討OA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的機制，為應(yīng)用OA治療白血病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品與主要試劑 人早幼粒系白血病HL-60細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。抗Caspase-9抗體購自美國Oncogene公司，抗Smac/DIABLO抗體購于上?？党缮锕こ逃邢薰荆笴yt-c抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，抗Bid抗體與抗β-Actin抗體均為美國Santa cruz公司產(chǎn)品。苯甲基磺酰氟(PMSF)與丙烯酰胺購自美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1藥物配制 OA溶于二甲基亞礬(DMSO)中，用含新生牛血清的RPMI-1640稀釋，配制成最終濃度800 μmol/L的儲存液。常規(guī)方法配制蛋白質(zhì)免疫印跡法試劑。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HL-60細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，加入含有胎牛血清、青霉素、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d傳代一次。實驗設(shè)空白對照組與OA用藥組?？瞻讓φ战M：HL-60細(xì)胞培養(yǎng)于含0.05%DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)基。OA用藥組：按照前期實驗結(jié)果，選擇80 μmol/L OA處理HL-60細(xì)胞12、24、48 h。

1.2.3細(xì)胞總蛋白的提取及Caspase-9測定 分別收集對照組和OA用藥組細(xì)胞。冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，PBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移細(xì)胞至Ep管，加入細(xì)胞裂解液，冰浴，離心，取上清，蛋白濃度經(jīng)二奎啉甲酸(BCA)法測定。煮沸使蛋白變性，等量蛋白(50 μg)經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝胺(SDS-PAGE)電泳分離 (β-Actin，Caspase-9：15 %)。轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素(NC)膜，封閉后加適量滴度一抗 (β-Actin，1∶500；Caspase-9，1∶500)，4℃輕搖過夜。加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)，TBS-T漂洗，Western Blotting Luminol Reagent化學(xué)發(fā)光法曝光顯影。

1.2.4線粒體的提取與去線粒體細(xì)胞質(zhì)的制備 收集各組細(xì)胞，PBS洗滌后，將細(xì)胞懸于含蛋白酶抑制劑的勻漿緩沖液，勻漿20次，離心去除細(xì)胞核及未破碎的細(xì)胞。取上清再次離心，所得的上清液即為胞質(zhì)部分。取沉淀，用勻漿緩沖液(含蛋白酶抑制劑并加入1 % Triton-100)洗2次并重懸，離心，所得上清液即為線粒體部分。制備線粒體勻漿，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定線粒體和去線粒體細(xì)胞質(zhì)的蛋白濃度。

1.2.5線粒體Bid蛋白和去線粒體細(xì)胞質(zhì)Smac/DIABLO、Cyt-C蛋白的檢測 空白對照組與OA用藥組分別收集2×107個HL-60細(xì)胞，提取線粒體并制備去線粒體細(xì)胞漿。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分別轉(zhuǎn)至NC膜，以兔抗人的Bid抗體孵育線粒體，以兔抗人Cyt-c抗體和兔抗人Smac/DIABLO抗體分別孵育去線粒體細(xì)胞漿，加適量滴度辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，Western Blotting Luminol Reagent化學(xué)發(fā)光法曝光顯影。

2 結(jié) 果

2.1OA對HL-60細(xì)胞Caspase-9蛋白表達(dá)的影響 42 kD分子量的β-Actin 蛋白為上樣量對照。不同時間的OA作用于HL-60細(xì)胞后，46 kD分子量的Pro-Caspase-9隨時間的增加而減少，這意味著降解后有活性的Caspase-9在逐漸增加。見圖1。

圖1 各組HL-60細(xì)胞Caspase-9蛋白的表達(dá)

2.2OA對HL-60細(xì)胞線粒體Bid蛋白表達(dá)的影響 HL-60細(xì)胞經(jīng)OA處理后，線粒體Bid表達(dá)逐漸增加，48 h線粒體Bid表達(dá)最高，見圖2。

圖2 各組HL-60細(xì)胞線粒體Bid蛋白的表達(dá)

2.3OA對HL-60細(xì)胞去線粒體胞質(zhì)Smac/DIABLO和Cyt-c蛋白表達(dá)的影響 HL-60細(xì)胞去線粒體胞質(zhì)中Smac/DIABLO和Cyt-c蛋白表達(dá)隨OA作用時間的增加而增加，提示在OA誘導(dǎo)的凋亡過程中伴隨Smac/DIABLO和Cyt-c從線粒體中釋放。見圖3。

圖3 各組HL-60細(xì)胞去線粒體胞質(zhì)Smac/DIABLO和Cyt-c蛋白的表達(dá)

3 討 論

在深入研究細(xì)胞凋亡調(diào)控機制與信號通路的過程中，以線粒體為核心的凋亡信號通路日益得到人們重視。線粒體及相關(guān)凋亡因子可以作為新型藥物的潛在作用靶點，為疾病(尤其是腫瘤)的治療提供新的策略〔4〕。線粒體凋亡信號通路被活化的關(guān)鍵事件是Cyt-c的釋放。眾多研究表明，在凋亡信號的刺激下，Bcl-2家族成員中的Bid蛋白被Caspases-8、GrB等蛋白酶剪切，形成截短的15 kD片斷tBid。tBid片段轉(zhuǎn)位至線粒體并誘導(dǎo)線粒體外膜通透性增加，引起Cyt-c、Caspase-9等促凋亡蛋白的釋放〔5,6〕。Smac/DIABLO 在Cyt-c的誘導(dǎo)下釋放至細(xì)胞質(zhì)〔7〕，并輔助Cyt-c活化Caspase-9，Caspase-9再活化Caspase-3，從而激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡。

Caspase-9是線粒體凋亡信號通路下游引起Caspase級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子，實驗過程中觀察到Caspase-9隨著OA的作用時間延長而增加，提示OA對HL-60細(xì)胞線粒體凋亡信號通路具有干預(yù)作用。為了研究Cyt-c和Smac/DIABLO量的變化，制備了去線粒體細(xì)胞漿，以避免提取細(xì)胞液時線粒體破碎所引起的線粒體成分在細(xì)胞液中的增加。研究結(jié)果提示在凋亡信號的刺激下，儲存于線粒體中的Cyt-c和Smac/DIABLO被釋放至細(xì)胞質(zhì)，參與HL-60細(xì)胞凋亡。另外，在凋亡信號誘導(dǎo)下，剪切形成的tBid蛋白經(jīng)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至線粒體，誘導(dǎo)線粒體中促凋亡蛋白釋放，使細(xì)胞凋亡。

綜上所述，OA可以通過以線粒體為核心的凋亡信號通路誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的凋亡。OA作用于其靶點，活化Caspases-8、GrB等蛋白酶，并剪切Bid蛋白，隨之tBid片段轉(zhuǎn)位至線粒體，使Cyt-c、Caspase-9、Smac/DIABLO等促凋亡蛋白釋放至胞質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的調(diào)控機制十分復(fù)雜，各個凋亡通路也并非獨立運轉(zhuǎn)而是彼此交錯、互相調(diào)控。接下來的研究工作，將尋找OA的準(zhǔn)確藥物靶點，更加深入地研究OA的促凋亡機制，爭取為OA應(yīng)用于臨床提供更多的實驗依據(jù)。

4 參考文獻(xiàn)

1Zhang P，Li H，Chen D，etal.Oleanolic acid induces apoptosis in human leukemia cells through caspase activation and poly(ADP-ribose) poly-merase cleavage〔J〕.Acta Biochim Biophys Sin，2007；39(10)：803-9.

2Ma W，Wang DD，Li L，etal.Caveolin-1 plays a key role in Oleanolic acid-induced apoptosis of HL-60 cells〔J〕.Oncology Reports,2014;32(1)：293-301.

3馬 微，李 麗，楊永旭，等.CAV-1基因在五種白血病細(xì)胞中的表達(dá)〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；33(19)：4754-6.

4Bouchier-Hayes L，Lartigue L，Newmeyer DD.Mitochondria：pharmacological manipulation of cell death〔J〕.J Clin Invest，2005；115(10)：2640-7.

5Chou JJ，Li H，Salvesen GS，etal.Solution structure of BID，an intracellular amplifier of apoptotic signaling〔J〕.Cell，1999；96(5)：615-24.

6周翔宇，劉 寧，閆 珊，等.S1通過線粒體途徑誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞凋亡〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014；34(1)：122-4.

7Creagh EM，Murphy BM，Duriez PJ，etal.Smac/Diablo antagonizes ubiquitin ligase activity of inhibitor of apoptosis proteins〔J〕.J Biol Chem，2004；279(26)：26906-14.