邱國權(quán)

(白城醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 白城 137000)

冠心病是危害老年人健康的嚴(yán)重疾病之一，抗冠心病藥物的研究一直是國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，相關(guān)研究顯示〔1，2〕，香薷屬植物多數(shù)具有良好的抗氧化、清除氧自由基的作用，其中黃酮是香薷屬植物起藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。為研究海州香薷總黃酮(THES)對缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，本次研究通過建立大鼠離體心臟缺血再灌注模型，研究THES對大鼠離體心臟缺血再灌注的改善效果，以期為臨床預(yù)防缺血再灌注損傷提供新的有效藥物。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 TFES由本校藥學(xué)院提供，總黃酮含量92.47%。本次實(shí)驗(yàn)中考馬斯亮藍(lán)蛋白檢測試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒、氯化三苯四氮唑測試盒均購于上海浩然生物技術(shù)有限公司，余下的試劑均為市售分析純。K-H液配置：NaCl 118 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，葡萄糖11 mmol/L，pH7.4。

1.2大鼠離體心臟缺血再灌注模型建立 雄性SD大鼠，斷頭之后立即開胸取出心臟，放于4℃的K-H液中清洗血液后迅速轉(zhuǎn)移并固定在Langendorff離心心臟灌流系統(tǒng)上，用K-H液進(jìn)行常規(guī)恒壓(76 mmHg)灌流，并流通95%O2+5%CO2飽和氣體，保持灌流液溫度37℃。將充水后的乳膠囊經(jīng)過切開的左心耳位置插進(jìn)左心室中，內(nèi)囊壓經(jīng)過特氟綸管將壓力轉(zhuǎn)送至壓力轉(zhuǎn)換器，采用RM6240多道生理信號采集處理系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄和分析。心肌缺血再灌注的過程為平衡30 min，停止灌注40 min，復(fù)灌120 min。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 健康清潔級Wistar雄性大鼠30只，體重240～260 g。購于長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號：SCXK(吉)：2011-0004。隨機(jī)分為五組，每組6只，分別為正常對照組，在K-H液平衡30 min之后，繼續(xù)灌流180 min；I/R組，在K-H液平衡30 min之后，繼續(xù)灌流30 min，全心停止灌流40 min模擬缺血過程，之后再灌注120 min；TFES低、中、高劑量組，同I/R組，但在停止灌流前10 min分別給予含TFES 1、10、100 μg/ml的K-H液灌流。

1.4血流動(dòng)力學(xué)檢測 本次研究選用RM6240多道生理信號采集處理系統(tǒng)對多項(xiàng)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測。首先向插入左心室的乳膠囊注水，將左心室的舒張末期壓力維持在4～8 mmHg，對研究過程中心率壓力乘積(RPP)、冠脈流量(CF)、左心室內(nèi)壓力最大升降速率(±dP/dtmax)。

1.5心肌梗死程度檢測 從灌流裝置上將心臟取下后放于-20℃冰箱中2 h，沿著心臟長軸垂直的方向?qū)⑵淝谐? mm的切片，置于37℃水浴中用1%的氯化三苯四氮唑孵育30 min。將心肌切片取出后用紗布吸干表面的水分并進(jìn)行稱重，按照20 ml/g的量加入二甲基亞砜進(jìn)行組織勻漿，在2 700 r/min條件下將勻漿液離心10 min后取上清液1 ml，在490 nm處測量其吸光度。心肌缺血損傷可導(dǎo)致細(xì)胞線粒體呼吸酶的活性降低，可導(dǎo)致心肌組織分解氯化三苯四氮唑，導(dǎo)致紅色產(chǎn)物Formazan量減少。本次研究中對其含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量，進(jìn)而對大鼠心肌缺血性損傷和TFES的保護(hù)作者進(jìn)行評價(jià)。

1.6心臟流出乳酸脫氫酶活性檢測 在復(fù)灌各時(shí)間點(diǎn)對冠脈流出液進(jìn)行收集，利用分光光度法檢測冠脈流出液中乳酸脫氫酶的含量。

1.7線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔開放的檢測 將線粒體用腫脹液(110 mmol/L KCl，20 mmol/L MOPS，10 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L K2PO4，pH 7.6)將蛋白濃度稀釋至0.30 mg/ml，同時(shí)在線粒體溶液中加入300 μmol/L的CaCl2溶液，誘導(dǎo)線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔開放，同時(shí)應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀對520 nm處線粒體吸光度變化情況進(jìn)行連續(xù)觀察10 min。

2 結(jié) 果

2.1TFES對缺血再灌注大鼠離體心臟血流動(dòng)力學(xué)影響 各項(xiàng)心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)在復(fù)灌期均出現(xiàn)異常。與正常對照組相比，I/R組RPP、CF、±dP/dtmax呈現(xiàn)進(jìn)行性降低，提示造模成功。TFES 1、10、100 μg/ml劑量組各復(fù)灌時(shí)間點(diǎn)RPP、CF、±dP/dtmax均明顯高于I/R組(P<0.05，P<0.01)，且呈一定的劑量依賴性。見表1。

表1 各復(fù)灌時(shí)間點(diǎn)各組大鼠離體心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)對比±s,n=6)

2.2TFES對缺血再灌注大鼠離體心臟心肌梗死程度影響 大鼠離體心臟停止灌流前用TFES 1、10、100 μg/ml進(jìn)行預(yù)處理，與I/R組相比，TFES 10、100 μg/ml劑量組均能明顯提高心肌Formazan含量，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且隨給藥劑量的增大心肌Formazan含量提升效果更為明顯。

2.3TFES對缺血再灌注大鼠離體心臟冠脈流出液中乳酸脫氫酶含量影響 恢復(fù)灌流后30、60、90 min時(shí)間點(diǎn)TFES 1、10、100 μg/ml劑量組中流出液中乳酸脫氫酶含量均明顯低于I/R組(P<0.01)；且隨給藥劑量的增大流出液中乳酸脫氫酶含量降低更為明顯?；謴?fù)灌流后120 min時(shí)間點(diǎn)時(shí)TFES 1、10、100 μg/ml劑量組與I/R組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4TFES對心肌線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔開放的影響 在分離出的離體心臟心肌細(xì)胞線粒體中加入200 μmol/L的CaCl2后能夠引起線粒體在520 nm處的吸光度降低，在給予TFES 1、10、100 μg/ml之后，CaCl2誘導(dǎo)的線粒體520 nm處吸光度降低被明顯抑制，與給藥前相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討 論

冠心病是老年人群中的高發(fā)病，由于老年人肝腎功能降低，對藥物毒副反應(yīng)的耐受性下降，用藥安全性一直是臨床治療中的難點(diǎn)〔3〕。因此，尋找療效顯著，副作用小的藥物對于老年冠心病患者具有重要意義。本次研究中建立了大鼠離體心臟缺血再灌注模型，對心臟在自主狀態(tài)下對藥物的反映進(jìn)行模擬。

急性心肌缺血性損傷梗死面積大小對于患者治療預(yù)后有著重要影響。心肌梗死面積的縮小常用于抗心肌缺血藥物療效的主要評價(jià)指標(biāo)〔4〕。本研究提示TFES中、高劑量能有效減輕缺血復(fù)灌后心肌梗死程度。血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)常用于對心功能評價(jià)。心肌細(xì)胞中乳酸脫氫酶廣泛存在于胞漿膜中，機(jī)體正常情況下血清中該酶的含量極少，當(dāng)出現(xiàn)缺血再灌注損傷時(shí)由于細(xì)胞膜及線粒體受到損傷，導(dǎo)致膜通透性提升，使乳酸脫氫酶釋放入血漿中，因此其可作為對心肌損傷程度的間接判斷指標(biāo)。本研究提示TFES低、中、高劑量組均能起到保護(hù)心肌的作用。相關(guān)研究顯示〔5〕，心肌線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔開放是機(jī)體中多器官和細(xì)胞損傷或死亡的共同通路。本研究提示TFES保護(hù)心肌的機(jī)制可能與抑制心肌線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔開放有關(guān)。

綜上所述，TFES能明顯改善大鼠離體心臟缺血再灌注損傷，且呈劑量依賴性，隨著TFES劑量的升高，改善效果增強(qiáng)。本次研究為TFES進(jìn)一步研發(fā)為修復(fù)心血管疾病的純中藥制劑提供了可行性依據(jù)。

4 參考文獻(xiàn)

1劉 瑩,李喜鳳,劉艾林，等.細(xì)皺香薷葉的化學(xué)成分研究〔J〕.中草藥,2009;40(9):1356-9.

2張紅曉,劉 佳,宋玉峰,等.海州香薷根系對銅脅迫的抗氧化響應(yīng)〔J〕.中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2012;28(27):204-8.

3王衛(wèi)紅,姚萬發(fā).老年糖代謝異常人群冠心病發(fā)病率及其危險(xiǎn)因素〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2013;33(21):5314-6.

4李 杰.老年急性冠脈綜合征患者血清MMP-9、NT-proBNP和hs-CRP水平與冠狀動(dòng)脈病變程度的關(guān)系〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2013；33(13):3221-2.

5郭 菁,熊蔚蔚,陶宇宏.乙酰水楊酸單用與聯(lián)用對不穩(wěn)定型心絞痛治療效果比較〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012;13(1):91-3.