吳 贇 陳 凌 汪義永 魏 斌

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科，福建 福州 350004)

大量的流行病學(xué)調(diào)查和嚴(yán)格的臨床對照統(tǒng)計分析，顯示牙周感染與動脈粥樣硬化(AS)密切相關(guān)〔1〕。牙齦卟啉單胞菌(Pg)是一種革蘭陰性厭氧菌,是目前公認(rèn)的牙周炎可疑致病菌，研究證實(shí)能夠促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展〔2〕。細(xì)胞因子表達(dá)調(diào)節(jié)異常在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中，發(fā)揮著關(guān)鍵作用。單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1可在多種細(xì)胞中表達(dá)〔3〕。白細(xì)胞介素(IL)-10是重要的炎癥調(diào)控因子，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用,小鼠AS模型已證實(shí)IL-10能顯著抑制泡沫細(xì)胞對脂肪顆粒的攝取,從而減少或延緩泡沫細(xì)胞的形成〔4〕。本實(shí)驗通過觀察Pg的脂多糖(LPS)對人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAECs)在mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯水平表達(dá)MCP-1、IL-10的影響,探討Pg促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑、儀器 新生牛血清(GIBCO，美國),Pg LPS(晶美生物工程公司), MCP-1酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(北京博凌科為生物科技),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega, 美國),凝膠成像分析系統(tǒng) (上海培清科技有限公司)，PCR擴(kuò)增儀 (Heraeus 公司, 德國)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 取原代HAECs(Scien Cell公司, 美國)接種于含生長因子、青鏈霉素和50 ml/L胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下復(fù)蘇并培養(yǎng)至形成單層,待鋪滿培養(yǎng)板底70% 左右時，消化傳代，取4～6代細(xì)胞用于實(shí)驗。

將生長良好的HAEC接種于6孔培養(yǎng)板，接種細(xì)胞濃度為1×105/ml，孵育24 h貼壁后，當(dāng)生長匯合度達(dá)到85%時棄原培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次加入Pg LPS，分LPS 150 ng/L，LPS 100 ng/L，LPS 10 ng/L，空白對照組。

1.3ELLSA法測定MCP-1、IL-10的表達(dá) 12 h后取細(xì)胞上清，標(biāo)本離心去除懸浮物后用于檢測。ELISA法按照試劑盒說明操作，加入終止液后在450 nm波長測量各反應(yīng)孔的吸光值(OD值)并繪制曲線，計算相應(yīng)的MCP-1、IL-10濃度值。

1.4HAECs中MCP-l、IL-10基因的RT-PCR檢測

1.4.1細(xì)胞RNA的提取與分離 使用Trizol提取總RNA，按RNA提取試劑盒說明進(jìn)行。取適量的RNA分別進(jìn)行定量與瓊脂糖凝膠電泳，鑒定提取效果，確定提取的RNA的質(zhì)量和濃度。根據(jù)濃度計算出2 μg RNA的體積。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的流程進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.4.2PCR檢測 引物序列如下：甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH):正義5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC- 3′,反義5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′,擴(kuò)增片段452 bp，退火溫度63℃。MCP-1引物序列:正義TCATGCACATCCTCACTCGT,反義CGGGATCTGTTTCTTTGCAT, PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物長度為297 bp，退火溫度55℃。IL-10引物：正義5′-AGCCTACATGACAATGAAGA-3′,反義5′-GGTTGAGGTATCAGAGGTAAT-3′產(chǎn)物長度為180 bp，退火溫度59℃。退火30 s, 72℃延伸1.5 min,共30個循環(huán),72℃延伸7 min。

1.4.3PCR產(chǎn)物分析 將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液以5∶1混合后在PCR 儀上擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠圖像分析儀拍照并分析圖像。以目的基因 mRNA 擴(kuò)增后產(chǎn)物的吸光度值與內(nèi)參照GAPDH mRNA擴(kuò)增后產(chǎn)物吸光度值的比值作為mRNA表達(dá)的相對值, 得到MCP-1、IL-10 mRNA表達(dá)的相對含量。

2 結(jié) 果

2.1ELLSA法檢測結(jié)果 在一定范圍內(nèi)HAECs中MCP-1的分泌量隨著LPS的濃度增加而增加，100 ng/L、150 ng/L Pg-L PS作用下HAECs MCP-1的分泌量與空白對照組相比明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，IL-10分泌量隨著LPS的濃度增加而降低,各實(shí)驗組與空白對照組相比有顯著性差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2電泳圖譜 見圖1，圖2。

2.3各組MCP-1和IL-10 mRNA比較 10 ng/LPg LPS作用時，HAECs MCP-1 mRNA的表達(dá)沒有明顯改變(P>0.05)，100 ng/L、150 ng/L Pg LPS作用下HAECs MCP-1 mRNA的表達(dá)與空白對照組相比明顯增高(P<0.05)。以 0、10、100、150 ng/L的梯度LPS 作用時，HAECs IL-10 mRNA的表達(dá)逐步減弱(P<0.05)。見表2。

表1 各組MCP-1、IL-10蛋白含量比較±s,n=6,pg/ml)

1:空白對照組;2: IPS 10 ng/L 組;3:LPS 100 ng/L 組;4:LPS150 ng/L 組

1:LPS 150 ng/L組; 2:LPS 100 ng/L 組; 3:LPS 10 ng/L組;4:空白對照組

表2 各組MCP-1和IL-10 mRNA水平比較±s,n=6)

3 討 論

AS是一種多因素疾病，炎癥反應(yīng)貫穿于AS的啟動形成和發(fā)展，在AS的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著極為重要的角色〔5〕。

Pg是目前公認(rèn)的牙周炎可疑致病菌。內(nèi)毒素是其細(xì)胞外膜上的主要致病成分，其化學(xué)本質(zhì)為LPS，在牙周病的炎癥啟動和進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用。多個研究顯示牙周炎會導(dǎo)致血液中LPS水平升高〔6〕。Ebersole等〔7〕對妊娠期牙周炎群體的研究中測出血液中LPS的含量為38～1 500 pg/ml；Pussinen等〔8〕報道隨著探診出血(BOP)位點(diǎn)增加，血清LPS水平上升。在牙周治療甚至是在咀嚼時都能釋放Pg及其LPS入血，提升循環(huán)LPS的水平，引起局部和全身炎癥并作用于血管內(nèi)皮〔9〕。

MCP-1在AS病變組織中激活，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子之一，與構(gòu)成AS病變的3種主要細(xì)胞(單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞)均有密切關(guān)系。通過小鼠造模實(shí)驗研究同樣也證實(shí)MCP-1參與免疫炎癥反應(yīng),進(jìn)而造成動脈壁內(nèi)皮細(xì)胞損傷，故認(rèn)為該基因的表達(dá)構(gòu)成了AS發(fā)病的重要機(jī)制〔10〕。IL -10是一種由多種細(xì)胞分泌的多功能細(xì)胞因子,能抑制T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞激活,抑制多種炎癥因子、生長因子的合成,并促進(jìn)其他抗炎因子的分泌, 是一 種理想的抗炎物質(zhì)。研究表明AS及再狹窄的發(fā)生與多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān),IL-10可能在AS和再狹窄的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。有實(shí)驗表明,IL-10不僅抑制單核/巨噬細(xì)胞的貼壁,還能抑制一些黏附細(xì)胞因子及趨化因子的產(chǎn)生和功能的發(fā)揮〔11〕。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Pg在AS斑塊及齦下菌斑中均有較高檢出率，深入分析后發(fā)現(xiàn)兩者存在極高相似度，認(rèn)為兩者具有高度同源性，證實(shí)了Pg在AS發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用。本實(shí)驗進(jìn)一步通過體外細(xì)胞實(shí)驗觀察Pg中LPS 對HAECs在mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯水平表達(dá)MCP-1、IL-10的影響。研究發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi),Pg中LPS呈劑量依賴性促進(jìn)HAECs細(xì)胞MCP-1的表達(dá)，同時減低IL-10的表達(dá)水平，推測Pg可能通過其入血的LPS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮表達(dá)MCP-1、抑制IL-10的產(chǎn)生，導(dǎo)致單核細(xì)胞激活,從而促進(jìn)冠狀動脈AS的發(fā)生，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

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