唐中生 謝高宇 陸 瑩 陳 波 張作濤 羅亞非

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室,貴州 貴陽(yáng) 550002)

血管性癡呆(VD)是導(dǎo)致腦組織損害引起的以認(rèn)知功能障礙為特征的癡呆綜合征〔1〕。腦缺血再灌注損傷的過(guò)程中腦內(nèi)氧自由基、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物等有毒代謝產(chǎn)物增多，對(duì)腦組織具有明顯的損傷作用，能引起一系列的炎癥因子表達(dá)使炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而加重神經(jīng)元的損傷〔2〕。缺血與再灌注早期產(chǎn)生的黏附分子和細(xì)胞因子構(gòu)成了缺血性炎性損傷的基礎(chǔ)〔3〕。以白介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α為代表的細(xì)胞因子在腦缺血后的炎性反應(yīng)中扮演著啟動(dòng)因素的角色，且在發(fā)病后數(shù)天至1 w內(nèi)占主導(dǎo)作用〔4〕。為探討VD發(fā)病與血清IL-1β與TNF-α的關(guān)系，本研究制備VD大鼠模型，采用穴位埋線治療，觀察VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化、海馬神經(jīng)元損傷減緩及血清IL-1β與TNF-α水平，探討穴位埋線治療VD的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠70只，體重280～300 g，清潔級(jí)，由重慶滕鑫比爾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷(xiāo)售有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(渝)2007-0006。

1.2實(shí)驗(yàn)器材 可吸收性外科縫線(經(jīng)絡(luò)疏通專(zhuān)用線)(中國(guó)中醫(yī)研究院眾益科技開(kāi)發(fā)公司)，電子天平(蘇州精密儀器廠)；DigBehv Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司)；微型動(dòng)脈夾(安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)；SDQ-30雙極射頻電凝器(蘇州手術(shù)器械廠)；一次性2.5 ml的注射針頭(江西洪達(dá)醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司)。

1.3藥品與試劑 水合氯醛、4%多聚甲醛、IL-1β(美國(guó)R&D Systems 公司生產(chǎn))、TNF-α檢測(cè)試劑盒(貴州平生生物技術(shù)有限公司提供)；尼莫地平片(正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：0801002)。

1.4VD大鼠模型的建立 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、VD模型組、穴位埋線組和尼莫地平組，采用改良的Pulsinelli四血管阻斷法(4-VO)建立VD大鼠模型〔5〕。模型制作成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠在4條血管阻斷后1～2 min內(nèi)，翻正反射消失，虹膜變白及瞳孔散大。

1.5治療方法 術(shù)后第7天開(kāi)始治療，除穴位埋線組外，其余各組治療均在每天上午9：00～11：00進(jìn)行，每日1次，連續(xù)治療15 d。①穴位埋線組。穴位選擇：百會(huì)、膈俞、氣海、三陰交、膻中。 穴位定位：以《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》定位位置為標(biāo)準(zhǔn)〔6〕。治療方法：將可吸收性外科縫線(4～0號(hào))剪成1 cm小段若干，放在已消毒紙上備用。使用時(shí)用鑷子將其裝入2.5 ml的注射針頭，然后再將預(yù)先剪去針尖的6.7 cm針灸針作為針芯穿入注射針頭內(nèi)，組成一套埋線工具。埋線時(shí)，先以碘酒消毒，乙醇脫碘后，將注射針頭刺入穴位，然后抵住針灸針針尾作注射狀，迅速將針頭內(nèi)的羊腸線推入穴內(nèi)，感覺(jué)注射針內(nèi)有空虛感時(shí)方可出針，并確認(rèn)羊腸線已埋入穴位內(nèi)。②尼莫地平組。按20 mg·kg-1·d-1的用量進(jìn)行灌胃治療。假手術(shù)組、模型組均給予蒸餾水1 ml/100 g灌胃。

1.6Morris 水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)〔7〕術(shù)后第28天開(kāi)始水迷宮測(cè)試。Morris水迷宮為圓形水池，直徑100 cm，深50 cm，水深30 cm，水溫(24±2)℃，池壁上4個(gè)等距離點(diǎn)分水池為4個(gè)象限，選第3象限在其中央放置平臺(tái)，平臺(tái)無(wú)色透明，直徑6 cm，高28 cm，平臺(tái)沒(méi)于水面下2 cm，水池周?chē)鷧⒄瘴锉３植蛔?。?～6天進(jìn)行定向航行實(shí)驗(yàn)，每日將大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的順序從各入水點(diǎn)(各象限水池壁中點(diǎn))靠池壁放入水中，記錄60 s內(nèi)大鼠從水中爬上站臺(tái)所需時(shí)間為逃避潛伏期；第7天行空間探索實(shí)驗(yàn)，將大鼠從第Ⅰ象限入水點(diǎn)放入水池，記錄2 min內(nèi)大鼠在第Ⅲ象限游泳時(shí)間和穿越站臺(tái)次數(shù)。

1.7血清采集及檢測(cè) Morris 水迷宮檢測(cè)之后，于腹股溝處切開(kāi)皮膚，剪斷股動(dòng)脈采集血液，入冰箱靜置過(guò)夜后采集血清以備進(jìn)行IL-1β與TNF-α含量檢測(cè)。開(kāi)顱取腦，取海馬組織固定12 h。經(jīng)梯度酒精脫水、透明、浸蠟、包埋后，連續(xù)冠狀切片(片厚5 μm)用Biomias99圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。HE染色，光鏡下觀察海馬神經(jīng)元的病理變化。

2 結(jié) 果

2.1穴位埋線對(duì)VD大鼠Morris水迷宮的影響 定位航行實(shí)驗(yàn)：平均逃避潛伏期反映大鼠的學(xué)習(xí)能力。模型組大鼠平均逃避潛伏期與假手術(shù)組比較明顯延長(zhǎng)(P<0.05，P<0.01)，穴位埋線組與模型組相比，平均逃避潛伏期縮短(P<0.01)，與尼莫地平組無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

空間探索實(shí)驗(yàn)：該實(shí)驗(yàn)反映了大鼠的記憶能力。模型組與假手術(shù)組比較，第Ⅲ象限活動(dòng)時(shí)間縮短、穿越站臺(tái)次數(shù)減少(P<0.01)，穴位埋線組與模型組比較，第Ⅲ象限活動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)、穿越站臺(tái)次數(shù)增多(P<0.01，P<0.05)，穴位埋線組與尼莫地平組無(wú)比較意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.2穴位埋線對(duì)VD大鼠血清IL-1β、TNF-α含量的影響 模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量比假手術(shù)組顯著升高(P<0.01)，穴位埋線組大鼠血清IL-1β、TNF-α含量雖然也高于假手術(shù)組(P<0.05)，但與模型組大鼠相比明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3穴位埋線對(duì)VD大鼠病理形態(tài)學(xué)的影響 圖1可見(jiàn)，HE染色見(jiàn)假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、密集，無(wú)變性、壞死和腫脹細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，胞質(zhì)豐富，無(wú)膠質(zhì)細(xì)胞增生現(xiàn)象；細(xì)胞核呈圓形、橢圓形。模型組海馬組織明顯水腫，血管擴(kuò)張充血，神經(jīng)元嚴(yán)重腫脹、變性及排列紊亂，并嚴(yán)重壞死，神經(jīng)纖維增粗紊亂。穴位埋線組海馬CA1區(qū)未出現(xiàn)水腫、見(jiàn)輕微血管擴(kuò)張充血，神經(jīng)元出現(xiàn)輕微腫脹，未見(jiàn)變性、排列紊亂和壞死，神經(jīng)纖維現(xiàn)增粗紊亂。尼莫地平組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密集，出現(xiàn)輕微水腫和血管擴(kuò)張充血，神經(jīng)元輕微腫脹和變性、無(wú)壞死，神經(jīng)纖維現(xiàn)增粗紊亂。

表1 各組大鼠每天平均逃避潛伏期的測(cè)試±s)

表2 各組大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)第Ⅲ象限活動(dòng)時(shí)間、穿越站臺(tái)次數(shù)及血清IL-1β、TNF-α含量±s)

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)觀察(HE，×400)

3 討 論

研究表明，不完全的缺血性損傷、局部及遠(yuǎn)處的缺血性改變等都與VD有關(guān)〔8〕。腦血流中斷和再灌注導(dǎo)致腦細(xì)胞壞死或凋亡，反復(fù)、多次缺血性腦血管事件發(fā)作可誘發(fā)認(rèn)知功能障礙和相關(guān)腦血管病的神經(jīng)功能障礙。研究表明，炎癥反應(yīng)在慢性腦缺血后繼發(fā)性神經(jīng)損傷中起主要作用〔9〕。腦缺血發(fā)生后，血漿及腦組織TNF-α、IL-1β含量均出現(xiàn)變化，并且隨時(shí)間變化而變化。IL-1β是一種具有多效性作用的促炎性細(xì)胞因子，是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一，在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。IL-1β通過(guò)誘導(dǎo)白細(xì)胞黏附，介導(dǎo)白細(xì)胞向缺血腦組織浸潤(rùn)，引起腦組織炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腦組織進(jìn)一步損傷。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌。在腦缺血再灌注后，TNF-α是最早產(chǎn)生并發(fā)揮作用的促炎細(xì)胞因子，是炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因素，在腦缺血早期TNF-α分泌或合成的增加是腦梗死形成的主要原因，它具有增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，誘導(dǎo)細(xì)胞黏附因子表達(dá)等作用。以IL-1β與TNF-α為代表的炎性細(xì)胞因子參與許多神經(jīng)病理過(guò)程，包括腦缺血引起急性神經(jīng)變性、老年性癡呆(AD)等慢性神經(jīng)變性。無(wú)論是炎性細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)，還是其誘發(fā)的其他活性物質(zhì)的過(guò)度表達(dá)，都將使反應(yīng)向不利于機(jī)體的方向發(fā)展。這些炎癥細(xì)胞因子在健康成人腦內(nèi)含量很低，只有在伴發(fā)炎癥及免疫反應(yīng)的病理情況下才明顯表達(dá)增多。IL-1β及TNF-α在腦缺血再灌注損傷引起的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起主要介導(dǎo)作用，體針針刺可抑制炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α及其mRNA的表達(dá)，從而降低組織或血清中其蛋白的含量〔10〕。大鼠急性腦缺血和再灌注30 min后，血漿IL-1β和TNF-α含量均有不同程度升高，循經(jīng)取穴電針能顯著降低血漿IL-1β、IL-6和TNF-α含量。說(shuō)明炎性細(xì)胞因子及由此介導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與缺血再灌注腦損傷過(guò)程，電針可通過(guò)阻斷炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)缺血再灌注腦損傷的保護(hù)作用〔11〕。

穴位埋線療法在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，采用不同型號(hào)的羊腸線，根據(jù)需要有選擇地埋入穴位，通過(guò)羊腸線對(duì)穴位的持續(xù)刺激作用，達(dá)到治療疾病的一種外治方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床各科〔12〕。臨床采用穴位埋線治療VD也取得了一定的效果，但是其治療VD的作用機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。中醫(yī)認(rèn)為，癡呆病人多屬本虛標(biāo)實(shí)，氣滯血瘀。氣虛則神失所養(yǎng)，瘀血?jiǎng)t可隨經(jīng)脈流行入腦，與精髓錯(cuò)雜，致使清竅受蒙，靈機(jī)呆鈍而出現(xiàn)神識(shí)不清，表情癡呆諸癥。本研究選取百會(huì)、膈俞、氣海、三陰交(雙)、膻中組成益氣活血方。百會(huì)為諸陽(yáng)、百脈之會(huì)，可開(kāi)竅醒神、回陽(yáng)固脫。膈俞有開(kāi)胸通膈治療氣滯血瘀之功。氣海培補(bǔ)元?dú)?。三陰交可健脾益氣，調(diào)補(bǔ)肝腎。膻中為氣會(huì)，有理肺氣、通乳絡(luò)之功。以上五穴共同組合，共奏益氣活血之功。本實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ)，運(yùn)用穴位埋線治療實(shí)驗(yàn)性VD大鼠，觀察大鼠神經(jīng)元的凋亡變化與埋線治療的療效關(guān)系，提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

Morris水迷宮已經(jīng)廣泛地用于動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶研究的實(shí)驗(yàn)。空間學(xué)習(xí)記憶是檢測(cè)動(dòng)物空間方向、反射時(shí)間、視知覺(jué)和結(jié)構(gòu)應(yīng)用等能力，從而評(píng)價(jià)其認(rèn)知水平的一種行為模式，是一類(lèi)關(guān)于場(chǎng)景和事件的學(xué)習(xí)記憶，因能較好地檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶功能，并有排除動(dòng)物在完成作業(yè)而經(jīng)過(guò)的途中所留下的排泄物和所分泌的外激素對(duì)其他動(dòng)物作業(yè)成績(jī)產(chǎn)生影響等優(yōu)點(diǎn)，因而在國(guó)內(nèi)外被廣泛采用〔13〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力較對(duì)照組明顯減退，應(yīng)用4-VO改良法成功復(fù)制了VD模型大鼠。穴位埋線能有效改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

本研究結(jié)果表明，降低血清IL-1β、TNF-α含量、緩解腦缺血后炎癥反應(yīng)，減輕海馬神經(jīng)元的損傷，可能是穴位埋線改善癡呆癥狀的機(jī)制之一。

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