陳施艷 馮飛陽 張志堅(jiān) 周海濤 吳秀麗

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建 福州 350005)

帕金森病(PD)是一種中老年人常見的運(yùn)動(dòng)障礙疾病，以選擇性中腦黑質(zhì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元死亡及腦內(nèi)出現(xiàn)Lewy小體為主要病理特點(diǎn)〔1〕。研究提示核因子(NF)-κB的激活與PD的病理機(jī)制有關(guān)〔2～6〕。Nanog是2003年Chambers等〔7〕和Mitsui等〔8〕分別用不同的研究戰(zhàn)略同時(shí)克隆得到的基因，能不依賴于LIF/Stat3獨(dú)自維持囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)和胚胎干細(xì)胞(ESC)的多能性，從而得到高度重視。Torres等〔9〕在研究Nanog維持干細(xì)胞分化潛能作用時(shí)意外發(fā)現(xiàn)Nanog 蛋白能與NF-κB蛋白結(jié)合，并抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄。本研究設(shè)想通過抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄來延緩PD的病理過程，從而達(dá)到治療該病的目的。在前期研究已成功構(gòu)建攜帶Nanog基因的慢病毒載體，并證實(shí)其能抑制小鼠骨髓間質(zhì)細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)〔10〕，以及抑制脂多糖誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB的轉(zhuǎn)錄〔11〕，同時(shí)證實(shí)了6-羥多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的PD大鼠模型腦內(nèi)存在炎癥因子的升高〔11〕。為考察轉(zhuǎn)Nanog基因在活體上的作用，本試驗(yàn)擬初步觀察轉(zhuǎn)Nanog基因?qū)?-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠模型腦內(nèi)NF-κB表達(dá)是否有影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠48只，體重250～300 g(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證：SCXK滬2007-0005)。動(dòng)物常溫飼養(yǎng),自由攝食、飲水，光照12 h，術(shù)前12 h 禁食。

1.2主要材料 ①慢病毒載體質(zhì)粒PNL-IRES .EGFP，包裝質(zhì)粒HELPER，包膜質(zhì)粒VSVG以及293T細(xì)胞均由美國杜蘭大學(xué)陳一平教授惠贈(zèng)。②Top10菌：由福建醫(yī)科大學(xué)林建銀教授惠贈(zèng)。③主要試劑：逆轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和Sal Ⅰ(Promega)，高保真Pfu ultra DNA聚合酶(Strategen)，Trizol以及脂質(zhì)體lipofectamin 2000(Invitrogen)，polybrene(Sigma)，質(zhì)粒抽提試劑盒(Qiagen)，DNA凝膠回收試劑盒(上海博亞生物公司)。胎牛血清(PAA)，DMEM、胰酶、EDTA，青鏈霉素(Gibco)，6-OHDA、阿樸嗎啡(APO，Sigma公司)，兔抗大鼠TH單克隆抗體、兔抗大鼠NF-κBp65多克隆抗體(武漢博士德公司)，TRITC羅丹明標(biāo)記羊抗兔IgG多聚體、辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG多聚體、DAB(北京中衫金橋公司)，多聚甲醛、DAPI染色液、免疫染色封閉液(碧云天公司)。腦立體定向儀(江灣一號(hào))，冰凍切片機(jī)(CRYOTOME SME，英國Thermo Shandon公司)，倒置相差熒光顯微鏡(IX70，日本OLYMPUS公司)，激光共聚焦顯微鏡(TCS SP5，德國Leica公司)。

1.3方法

1.3.1攜帶Nanog基因慢病毒載體構(gòu)建、鑒定 慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定課題組已在前期完成，所獲病毒載體滴度為6.1×106～6.8×106IU/ml。該慢病毒載體質(zhì)?；蛐蛄兄械哪康幕蚺cEgfp基因之間以IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))相連接，使二者轉(zhuǎn)錄出一條單順反子，同時(shí)翻譯出兩種蛋白，從而通過觀察EGFP的表達(dá)直觀地觀測(cè)目的基因的表達(dá)。構(gòu)建的載體的鑒定見已發(fā)表論文〔10〕。

1.3.2PD大鼠模型的制備 采用腦立體定向儀注射6-OHDA誘導(dǎo)方法制備PD大鼠模型〔12，13〕。用微量注射器將3 μl濃度為2 μg/ μl的6-OHDA(含0.2%抗壞血酸)分別緩慢勻速地注射到大鼠左側(cè)紋狀體內(nèi)的上述各點(diǎn)，注藥速度為1 μl/min，留針10 min后緩慢退針(以1 mm/min速度)，再用微量注射器將5 μl攜帶Nanog基因的慢病毒載體，或5 μl慢病毒空載體，或同劑量PBS分別注射到6-OHDA+Nanog組、6-OHDA+PNL組與6-OHDA+PBS組大鼠左側(cè)紋狀體內(nèi)的上述各點(diǎn)。用骨蠟封閉顱骨孔，縫合皮膚，置籠喂養(yǎng)。術(shù)后7 d內(nèi)，每天經(jīng)腹腔給予20萬U青霉素以預(yù)防感染。

1.3.3實(shí)驗(yàn)分組 清潔級(jí)雄性SD大鼠48只(剔除術(shù)后死亡1只，無體征4只)，隨機(jī)分4組：①正常對(duì)照組(n=12)； ②6-OHDA+PBS組(n=12)； ③6-OHDA+PNL組(n=12)； ④6-OHDA+Nanog組(n=12)。因預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示動(dòng)物在注射6-OHDA后近14 d才有明顯旋轉(zhuǎn)行為改變，上述各組再按時(shí)間點(diǎn)分為注射后第1天(n=6)、注射后第14天(n=6)亞組。所有動(dòng)物均在室溫22～25℃飼養(yǎng)，光線12 h交替，自由飲水、進(jìn)食，在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)反復(fù)檢測(cè)無異常旋轉(zhuǎn)行為。

1.3.4APO誘發(fā)旋轉(zhuǎn)觀察 于注射后每天經(jīng)腹腔注射0.5 mg/kg的APO，誘發(fā)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，注射后5 min觀察各組大鼠旋轉(zhuǎn)行為的改變，計(jì)算大鼠每分鐘的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)以動(dòng)物向注射對(duì)側(cè)不改變方向旋轉(zhuǎn)360°計(jì)為旋轉(zhuǎn)1次，每只動(dòng)物每次記錄30 min，直至第14天。

1.3.5TH免疫組化檢測(cè) 各亞組動(dòng)物分別在注射后第1天與第14天，用10%水合氯醛麻醉后，經(jīng)升主動(dòng)脈注入肝素生理鹽水及4%多聚甲醛溶液進(jìn)行灌注固定，斷頭取腦置固定液中過夜。于中腦區(qū)行冰凍連續(xù)冠狀切片，厚約20 μm，自前囟后5 mm層面開始，每隔5張選取一張，每5張為一組，共取4組。一組用于TH免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)步驟按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行。在顯微鏡下觀察，胞質(zhì)棕染者可判定為TH陽性細(xì)胞。每只大鼠的5張切片置顯微鏡下計(jì)數(shù)黑質(zhì)區(qū)TH免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元，分別累計(jì)大鼠注射側(cè)黑質(zhì)區(qū)TH免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目。

1.3.6腦內(nèi)Nanog基因表達(dá)的觀測(cè) 各亞組的取材同1.3.5步驟，取一組用于腦內(nèi)Nanog基因表達(dá)的觀測(cè)。在熒光顯微鏡下，切片中注射針道周0.5 mm 范圍內(nèi)任意選4個(gè)視野，計(jì)算其表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞個(gè)數(shù)，取均數(shù)。

1.3.7NF-κBp65免疫組化檢測(cè) 各亞組的取材同1.3.5步驟。取一組用于NF-κBp65免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)步驟按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行。在顯微鏡下觀察，胞質(zhì)棕染者可判定為NF-κBp65陽性細(xì)胞。每只大鼠的5張切片置顯微鏡下計(jì)數(shù)紋狀體區(qū)NF-κBp65免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元，每張切片在高倍鏡下(×200)隨機(jī)選擇3個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，累計(jì)后取平均值。

1.3.8共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)NF-κBp65的表達(dá) 各亞組的取材固定同1.3.5步驟。取一組用于共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)NF-κBp65的表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1APO誘發(fā)旋轉(zhuǎn) 大鼠注射后1～7 d的各亞組均未誘發(fā)旋轉(zhuǎn)，第8～9天除正常對(duì)照組外，有約1/2大鼠可誘發(fā)旋轉(zhuǎn)，在注射后第10～14天各組均可誘發(fā)旋轉(zhuǎn)，在第14天6-OHDA+Nanog組(5.25±0.96)r/min，大鼠APO誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)低于6-OHDA+PNL組(8.34±2.75)r/min與6-OHDA+PBS組(8.82±1.75)r/min(均P<0.05)。

2.2Nanog基因在腦內(nèi)的表達(dá) 6-OHDA+PBS組幾無綠色熒光表達(dá)，而在6-OHDA+PNL組與6-OHDA+Nanog組的針道周圍0.5 mm范圍內(nèi)觀察到大量綠色熒光陽性細(xì)胞，且兩組之間的陽性細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1、表1。

表1 各組大鼠腦內(nèi)綠熒光陽性細(xì)胞數(shù)±s,n=6)

2.3各組大鼠中腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元的觀察 大鼠注射側(cè)中腦可見TH陽性神經(jīng)元分布于黑質(zhì)，其形態(tài)為大多角形或錐形，胞質(zhì)棕染。注射后第1天，6-OHDA+PBS組、6-OHDA+PNL組與6-OHDA+Nanog組損毀側(cè)的TH陽性細(xì)胞數(shù)與正常對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；注射后第14天，除正常對(duì)照組外，其他各組大鼠黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)普遍較注射后第1天減少(P<0.01)，但6-OHDA+Nanog組損毀側(cè)黑質(zhì)存活的TH陽性細(xì)胞數(shù)高于6-OHDA+PNL組與6-OHDA+PBS組(P<0.01)，見圖2、表2。

2.4各組大鼠紋狀體區(qū)NF-κBp65陽性神經(jīng)元的觀察 注射后第1天，正常組幾乎未見NF-κBp65表達(dá)，6-OHDA+PBS組、6-OHDA+PNL組與6-OHDA+Nanog組NF-κBp65陽性表達(dá)均明顯增高，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；注射后第14天6-OHDA+Nanog組陽性細(xì)胞數(shù)低于6-OHDA+PNL組與6-OHDA+PBS組，也低于本組注射后第1天。見圖3、表3。

表2 各組大鼠注射側(cè)腦組織黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)±s,n=6)

圖1 各組大鼠腦紋狀體綠熒光陽性細(xì)胞(×200)

圖2 各組大鼠腦組織黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞的表達(dá)(DAB，×200)

表3 各組大鼠腦紋狀體區(qū)NF-κBp65表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)±s,n=6)

圖3 各組大鼠腦組織紋狀體NF-κBp65的表達(dá)(DAB，×200)

2.5共聚焦顯微鏡觀察NF-κBp65的定位表達(dá)及變化 激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為488/525 nm的FITC呈綠色熒光，表示病毒載體轉(zhuǎn)染存活；激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為340/488 nm的DAPI呈藍(lán)光熒光，表示組織的細(xì)胞核染色；激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為488/525 nm的TRITC呈紅色熒光，表示NF-κBp65的表達(dá)。在共聚焦顯微鏡下，觀察到注射后1、14 d的6-OHDA+PNL組與6-OHDA+Nanog組的病毒載體轉(zhuǎn)染均存活，表達(dá)綠色熒光。注射后1 d、14 d的6-OHDA+PBS組、6-OHDA+PNL組與6-OHDA+Nanog組的NF-κBp65都有明顯的表達(dá)，并向核內(nèi)轉(zhuǎn)移。見圖4，圖5。

圖4 熒光染色觀察第1天NF-κBp65在各組大鼠腦組織紋狀體的表達(dá)情況(×400)

圖5 熒光染色觀察第14天NF-κBp65在各組大鼠腦組織紋狀體的表達(dá)情況(×400)

3 討 論

Hebert等〔14〕在多次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均證實(shí)阻斷NF-κB激活能保護(hù)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元。為證實(shí)這一可能及探討有效的阻斷NF-κB方法，Hill等〔15〕發(fā)現(xiàn)Nanog可以與Stat3協(xié)同作用抑制NF-κB的活性從而維持小鼠胚胎干細(xì)胞的多潛能性，Torres等〔9〕發(fā)現(xiàn)Nanog能與NF-κB蛋白結(jié)合，并抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄。Nanog基因存在于人與動(dòng)物的基因組，只是在發(fā)育的后期處于沉默狀態(tài)，如果在疾病的情況下，活化該基因就有可能帶來有益的治療效果。因此，我們前期構(gòu)建了攜帶Nanog基因的慢病毒載體，并證實(shí)Nanog能較為完全地抑制小鼠骨髓間質(zhì)細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)〔10〕，又證實(shí)了Nanog能抑制脂多糖誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中NF-κB的轉(zhuǎn)錄〔10〕。在上述基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用6-OHDA低劑量單側(cè)毀損的方法建立PD大鼠模型，植入已帶有Nanog基因的慢病毒載體來觀察轉(zhuǎn)Nanog基因的表達(dá)對(duì)NF-κB的表達(dá)是否有抑制作用。結(jié)果顯示注射后14 d 6-OHDA+Nanog組損毀側(cè)的紋狀體NF-κBp65的表達(dá)強(qiáng)度低于6-OHDA+PNL組與6-OHDA+PBS組，同時(shí)其黑質(zhì)存活的DA能神經(jīng)元較多，而且APO誘發(fā)的向健側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少，這與Blandini等〔16〕報(bào)告的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的DA能神經(jīng)元損毀程度與APO誘導(dǎo)后大鼠向健側(cè)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)呈正相關(guān)是一致的，也表明6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠經(jīng)轉(zhuǎn)Nanog基因后黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的DA能神經(jīng)元損毀程度較輕，這種減輕很可能來源于Nanog對(duì)NF-κBp65的抑制。

綜上所述，雖然本實(shí)驗(yàn)還較為初期，但其結(jié)果提示Nanog對(duì)NF-κBp65的抑制在一些特定疾病的治療很可能具有較好效果。由于Nanog蛋白是生物體內(nèi)的天然蛋白，不屬外來物質(zhì)，推測(cè)在臨床上應(yīng)用會(huì)有一定優(yōu)勢(shì)。但如何在特定條件、特定時(shí)間與特定部位啟動(dòng)Nanog基因，可能還有一段較長(zhǎng)的路要走，繼續(xù)探討是很有意義的。

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