賀小平 董賢慧 趙靜怡 徐 倩 郝云濤 張夢鑫

(承德醫(yī)學(xué)院脊髓損傷與修復(fù)研究室，河北 承德 067000)

最常見的脊髓損傷(SCI)多來自于外傷所致脊柱骨折或骨折脫位。SCI預(yù)后很差，致殘率極高，是造成癱瘓的主要原因，給社會(huì)、家庭和個(gè)人均帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。因此，SCI是全世界神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域所面臨的一個(gè)巨大難題。SCI所致的偏癱、截癱或肢體痿軟等癥，中醫(yī)認(rèn)為屬于督脈損傷，瘀血阻絡(luò)，加之患者元?dú)獯髠揖门P傷氣，多見氣虛血瘀癥所以用BYHWD治療SCI可以有良好的療效。補(bǔ)陽還五湯(BYHWD)出自清代名醫(yī)王清任所著的《醫(yī)林改錯(cuò)》，由生黃芪、川芎、當(dāng)歸尾、地龍、桃仁、紅花、赤芍等7味藥物組成，諸藥合用共奏益氣活血通絡(luò)之功，原用于氣虛血瘀型中風(fēng)所致半身不遂、口眼歪斜、語言謇澀等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明BYHWD具有改善血液流變學(xué)、抗血栓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)神經(jīng)及促神經(jīng)生長、抗腦缺血再灌注損傷及抗心肌缺血等作用〔1，2〕。本研究旨在探討不同劑量BYHWD對(duì)SCI后肢運(yùn)動(dòng)功能的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性Wistar大鼠50只，體重(250±5)g，天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，合格證號(hào)：0003327。購進(jìn)后進(jìn)行兩周預(yù)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：20℃～29℃，相對(duì)濕度40%～60% RH，自由進(jìn)食水。將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、SCI模型組和BYHWD組，其中BYHWD組根據(jù)給藥劑量又分為低、中、高劑量3個(gè)亞組，每組10只。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品及給藥 BYHW的制備及給藥方法：BYHWD飲片顆粒劑由深圳華潤三九現(xiàn)代中藥有限公司饋贈(zèng)。其水溶液按《醫(yī)林改錯(cuò)》原方所載的藥味用量(按文獻(xiàn)每錢以3 g換算)，即生黃芪120 g,當(dāng)歸尾6 g,赤芍5 g,地龍、川芎、桃仁、紅花各3 g生藥飲片的顆粒劑混勻后；用100℃蒸餾水配制成含生藥飲片2.0 g/ml的BYHWD顆粒劑水溶液備用；各組大鼠連續(xù)灌服2 w，1 次/d，BYHWD中劑量組給藥體積用藥按照3 倍臨床等效劑量換算灌胃給藥，為20 ml/kg，即4 ml/d，高劑量組6 ml/d，低劑量組2 ml/d。給藥時(shí)間從術(shù)前30 min起,至術(shù)后3 w末結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

1.3大鼠SCI模型的建立 大鼠采用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，麻醉成功后，剪去大鼠背部毛大約5 cm×3 cm，大鼠以俯臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，對(duì)背部常規(guī)消毒鋪無菌單，通過摸肋骨的方法定位T10為中心，作長約4 cm的縱行皮膚切口，依次切開各層皮下組織，顯微器械分開棘突兩側(cè)豎脊肌，成功暴露T10棘突及椎板，微型咬骨鉗咬除T10棘突及棘間韌帶，在10倍手術(shù)放大鏡下咬除黃韌帶及椎板，成功暴露T10段脊髓硬膜，剪開硬膜，分離包裹在脊髓表面的神經(jīng)根，暴露T10段脊髓，采用自制的“可控?fù)舸蚱鳌睋舸騎10段脊髓，并使重物壓迫脊髓2 min，建立SCI模型，縫合硬膜及傷口。假手術(shù)組只需咬除椎板及黃韌帶，保留硬脊膜的完整性，縫合傷口。

1.4大鼠術(shù)后護(hù)理 術(shù)后各組大鼠連續(xù)給予青霉素3 d，預(yù)防感染。模型組大鼠每天早中晚3次人工膀胱排尿，直至建立反射性膀胱排空，大約1～7 d，每天的護(hù)理分3個(gè)時(shí)間段：早8∶00-9∶00為晨間護(hù)理，中午2∶00-3∶00為午間護(hù)理，晚8∶00-9∶00為晚間護(hù)理。

1.5SCI模型制作成功的標(biāo)準(zhǔn) 應(yīng)符合以下條件：①在手術(shù)中顯微鏡下直視脊髓受擊打出現(xiàn)斷端。②擊打大鼠脊髓時(shí)出現(xiàn)大鼠尾部痙攣性擺動(dòng)。術(shù)后安靜狀態(tài)下，大鼠后肢癱瘓，鼠尾可出現(xiàn)小幅度不自主的痙攣性擺動(dòng)，用手指壓迫大鼠的鼠尾，鼠尾可出現(xiàn)痙攣、卷曲、張力過高及抽搐等現(xiàn)象。

1.6對(duì)各組大鼠進(jìn)行BBB評(píng)分〔3〕后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分分別在于造模前1 d，造模后1、7、14和21 d進(jìn)行。評(píng)定時(shí)間均統(tǒng)一為上午8∶00開始。評(píng)分為2人合評(píng)。為避免人為因素的干擾，采用雙盲對(duì)照進(jìn)行評(píng)分，參評(píng)人員均為熟悉本評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)且不參與本實(shí)驗(yàn)的人員。將動(dòng)物置于平坦不滑、光線充足的桌面上觀察后肢關(guān)節(jié)活動(dòng)，并對(duì)其進(jìn)行功能評(píng)分，第一步(0～7 分)評(píng)判后肢關(guān)節(jié)活動(dòng)；第二步(8～13 分)評(píng)判動(dòng)物的步態(tài)和協(xié)調(diào)功能；第三步(14～21 分)評(píng)判動(dòng)物運(yùn)動(dòng)中爪的精細(xì)動(dòng)作。3 項(xiàng)滿分21 分。兩后肢分別評(píng)分，記錄平均值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行方差分析和LSD組間比較。

2 結(jié) 果

大鼠麻醉清醒后，假手術(shù)組大鼠行走輕度異常，術(shù)后1 d完全恢復(fù)正常；SCI模型組大鼠損傷平面以下完全癱瘓。術(shù)后第1天BYHWD組與SCI模型組大鼠BBB評(píng)分未見明顯差異(P>0.05)；術(shù)后第7～21天，低劑量BYHWD組與SCI模型組大鼠BBB評(píng)分未見明顯差異(P>0.05)；中、高劑量BYHWD組與均高于同期SCI模型組(P<0.05)。見表1。

表1 不同劑量BYHWD對(duì)各組大鼠BBB評(píng)分的影響±s,n=10)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用BBB法評(píng)價(jià)神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能，該法分級(jí)細(xì)致，幾乎包括了SCI后大鼠后肢恢復(fù)過程中所有行為學(xué)變化，且與SCI的程度高度相符。因此，本實(shí)驗(yàn)采用該方法進(jìn)行大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的評(píng)分，該法也是目前許多研究者較為推崇的一種方法。

BYHWD是我國傳統(tǒng)的中藥方劑，應(yīng)用BYHWD治療SCI可以有良好的療效。但其治療SCI的機(jī)制目前還不是很清楚。

SCI后的病理生理機(jī)制是一個(gè)至今仍未解決的極其復(fù)雜的過程，其中包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，繼發(fā)性損傷即引起一系列遲發(fā)性神經(jīng)壞死而造成的損傷，SCI后不同時(shí)間段內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞存活狀態(tài)對(duì)于SCI后的神經(jīng)元的潰變、神經(jīng)再生和運(yùn)動(dòng)的功能恢復(fù)有著非常重要的影響。近年來人們對(duì)于SCI后細(xì)胞死亡的研究手段大多限于細(xì)胞水平，SCI后其超微結(jié)構(gòu)改變的形態(tài)學(xué)研究報(bào)道并不多見。

繼發(fā)性損傷是SCI后造成脊髓受損的主要因素，最終可造成脊髓的繼發(fā)性缺血、缺氧。缺氧可使細(xì)胞內(nèi)水和電解質(zhì)紊亂、酸度增高，還可引起粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及核蛋白體的損傷，使蛋白質(zhì)的合成功能發(fā)生障礙，這些變化可進(jìn)一步損傷溶酶體膜，導(dǎo)致溶酶體內(nèi)的各種水解酶的激活和釋放，從而更進(jìn)一步加重了細(xì)胞內(nèi)其他結(jié)構(gòu)的損傷。如果損傷過于嚴(yán)重，超過細(xì)胞自身的代償能力，細(xì)胞代謝停止，發(fā)生死亡。

常見的SCI模型建立方法有脊髓壓迫損傷模型、脊髓切割損傷模型、脊髓牽拉損傷模型、脊髓缺血損傷模型、脊髓火器傷模型、化學(xué)性損傷、脊髓鉗夾損傷模型、脊髓吸除損傷模型、環(huán)扎法致?lián)p傷、橫向骨折脫位致?lián)p傷等。

本實(shí)驗(yàn)采用自制擊打器建立SCI模型屬于脊髓撞擊損傷模型，此法簡單易行，制作成本低，易于復(fù)制，可通過調(diào)整重錘的重量和墜落高度來改變撞擊能量，也可通過調(diào)整打擊板的大小、形狀等來調(diào)整撞擊的部位和范圍，并且保持了硬脊膜完整，可有效防止外源性成分侵入SCI區(qū)域，并防止脊髓外露與腦脊液外漏，是目前與臨床SCI相關(guān)性最好的一種。這種模型較接近人類SCI的病理生理特點(diǎn)及變化規(guī)律，造成脊髓水腫、缺血并繼發(fā)一系列損傷，能夠很好地模擬人類脊髓受損的過程，對(duì)研究SCI后神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的病理變化、再生規(guī)律和相互作用、探索神經(jīng)保護(hù)策略等有較大幫助，因此該法一直沿用至今。

近年來，越來越多的神經(jīng)科學(xué)工作者投入到BYHWD治療SCI的研究中來，單參考國內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，BYHWD的給藥濃度及藥物劑量均不盡相同。

本實(shí)驗(yàn)推論灌胃給予BYHWD中劑量時(shí)已達(dá)到最佳治療濃度，再增加藥物濃度已不能增加治療效果，故認(rèn)為中劑量是BYHWD治療SCI的最佳藥物濃度。

目前，BYHWD治療SCI的機(jī)制還不清楚，其可能機(jī)制為：①改善損傷后組織的缺血和炎癥反應(yīng)〔4〕；②抑制細(xì)胞凋亡〔5〕，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞〔6〕；③抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)損傷的反應(yīng)〔7〕；④促進(jìn)軸突再生作用〔8〕；⑤抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)〔9〕；⑥改善損傷后組織水腫〔10〕等。本實(shí)驗(yàn)確定了BYHWD治療SCI的最佳藥物濃度，為進(jìn)一步研究BYHWD治療脊髓損傷的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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