柳 嘉 趙松穎 劉 鍵

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院血液科，河北 保定 071000)

尿激酶型纖溶酶原激活物受體CD87屬于特異性可飽和的受體之一，已有研究證實(shí)，其在惡性腫瘤細(xì)胞中均存在表達(dá)增高的現(xiàn)象，并參與腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移或是增殖、分化與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等〔1〕，但近年來研究證實(shí)，在白血病細(xì)胞中亦存在CD87的表達(dá)〔2〕，本研究以急性髓性白血病患者為研究對(duì)象，采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其進(jìn)行檢測，以期探索急性髓性白血病患者中CD87表達(dá)與臨床表現(xiàn)及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2010年3月至2013年3月在我科就診的48例急性髓性白血病患者，均為初發(fā)者，排除其他嚴(yán)重血液疾病、精神疾病，在知情同意的基礎(chǔ)上，歸為觀察組，納入研究。選擇同時(shí)間段我科收治的36例急性淋巴細(xì)胞白血病患者，對(duì)照組，所有患者中男52例，女32例；年齡50～73〔平均(57.8±1.5)〕歲；依據(jù)法國、美國、英國聯(lián)合(FAB)分型標(biāo)準(zhǔn)，其中M1 10例,M2 35例,M3 10例,M4 4例,M5 6例；L1 15例,L 23例,L 31例。

1.2研究方法

1.2.1試劑及材料 淋巴細(xì)胞分離液(生產(chǎn)廠家：上海試劑二廠)；CD87單抗(生產(chǎn)廠家：America Diagnostic公司)異硫氰酸熒光素標(biāo)記羊抗鼠單抗(生產(chǎn)廠家：邦定公司)；胎牛血清(生產(chǎn)廠家：杭州四季青公司)；氟波酯(PMA)(生產(chǎn)廠家：Sigma公司)；RPMI-1640及逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV(生產(chǎn)廠家：Gibco公司)；6寡聚核苷酸引物及RNA酶抑制劑(生產(chǎn)廠家：華美生物工程公)司。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測方法 取所有患者的骨髓血，通過淋巴細(xì)胞分離液，制備單個(gè)核細(xì)胞懸液，洗滌之后，計(jì)數(shù)錐蟲藍(lán)活細(xì)胞，而后根據(jù)試劑盒中的操作步驟進(jìn)行檢測，每例檢測5 000～10 000個(gè)細(xì)胞，以熒光陽性細(xì)胞>20%者判斷為陽性。

1.2.3誘導(dǎo)分化白血病細(xì)胞株 將白血病細(xì)胞株(HL-60、U937、K562)細(xì)胞懸浮于含15%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液之中，而后分別加入PMA，保持細(xì)胞起始密度為2×105/ml，而后將其放置在溫度與條件適宜的培養(yǎng)箱之中5 d，分別在不同時(shí)間段(T0=作用前、T1=作用后1 d、T2=作用后3 d、T3=作用后5 d)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD87的表達(dá)變化情況。

1.2.4細(xì)胞形態(tài)觀察及硝基四氮唑藍(lán)(NBT)還原試驗(yàn) 將白血病細(xì)胞株細(xì)胞在前述不同時(shí)間段分別進(jìn)行細(xì)涂片拍樣，進(jìn)行瑞氏染色后于光鏡下觀察形態(tài)。另取部分培養(yǎng)細(xì)胞懸液加入等量0.2%NBT Hank液混勻后，37℃孵育后進(jìn)行離心制片，瑞氏染色，進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.5逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測方法 根據(jù)CD87 cDNA序列設(shè)計(jì)合成引物(由法國Genset公司合成)，將設(shè)計(jì)好的引物序列，其中β-actin作為內(nèi)參照(由中國科學(xué)院上海細(xì)胞所合成)的引物序列為，根據(jù)試劑盒中的操作步驟，依次進(jìn)行提取總RNA、計(jì)算RNA濃度、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增，最后行糖凝膠電泳，在紫外光度分度儀下進(jìn)行觀察與照相，并采用GS300吸光度掃描儀(生產(chǎn)廠家：Hoefer Scientific Instruments公司)進(jìn)行定量分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者的CD87表達(dá)情況 觀察組中患者CD87的陽性率(54.17%)顯著高于對(duì)照組(0%)(P<0.01)。

2.2CD87陽性與陰性者在臨床表現(xiàn)及預(yù)后的比較 與陰性者比較，CD87陽性者的髓外浸潤比例與外周血幼稚細(xì)胞均升高明顯(P<0.01)，CR比例則降低明顯(P<0.05)。見表1。

2.3白血病細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中不同時(shí)間段CD87表達(dá)變化 隨著時(shí)間的增加，白血病細(xì)胞株的CD87表達(dá)，均呈現(xiàn)增加的趨勢，其中U937在作用前其陽性表達(dá)率即已達(dá)到(92.3±4.4)%，其作用主要表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度的改變。見表2。

2.4PMA作用前后白血病細(xì)胞CD87 mRNA水平變化 PMA作用前，U937中CD87 mRNA含量明顯高于HL-60、K562(P<0.01)；經(jīng)PMA作用后，三組細(xì)胞株中的CD87 mRNA均明顯增加(P<0.05)。見表3。

表1 CD87陽性與陰性者在臨床表現(xiàn)及預(yù)后的比較〔n(%)〕

表2 白血病細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中不同時(shí)間段CD87表達(dá)變化±s)

表4 PMA作用前后白血病細(xì)胞CD87 mRNA水平變化±s)

3 討 論

尿激酶型纖溶酶原激活物受體CD87作為糖化磷脂酰肌醇(GPI)-錨膜蛋白，分子量在55 000～60 000之間,可對(duì)于細(xì)胞膜上的纖溶酶進(jìn)行識(shí)別，并與其激活物相結(jié)合，組成蛋白水解系統(tǒng)，參與白細(xì)胞浸潤及組織重建〔2〕。CD87主要在成熟的粒、單核及嗜酸細(xì)胞中表達(dá)，在正常造血前體細(xì)胞不表達(dá)〔3〕。

尿激酶(uPA)通過CD87結(jié)合于細(xì)胞表面，其主要通過將結(jié)合于細(xì)胞表面鄰近的纖溶酶原進(jìn)行激活，并將其轉(zhuǎn)變?yōu)榭山到庖恍┘?xì)胞外基質(zhì)成分的纖溶酶，同時(shí)，其還可將其他金屬蛋白酶原進(jìn)行激活以降解細(xì)胞外基質(zhì)。可見，CD87在細(xì)胞組織的纖溶中發(fā)揮著重要作用，主要涵蓋啟動(dòng)、定位和擴(kuò)大作用，同時(shí)，其還可參與多種生理病理過程，包括組織修復(fù)、血管形成以及腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移等〔4〕。CD87主要表達(dá)于成熟的粒、單核細(xì)胞，其已脫離骨髓及血管，在組織中游走而參與炎癥及免疫反應(yīng)〔5〕。在白血病分型中，M5中多見CD87的表達(dá)，而M5型患者多出現(xiàn)肝、脾、皮膚、黏膜等髓外組織浸潤表現(xiàn)。推測白血病細(xì)胞CD87表達(dá)可能與其脫離骨髓進(jìn)入外周血循環(huán)以及對(duì)髓外組織的浸潤有關(guān)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD87表達(dá)與急性髓性白血病的臨床表現(xiàn)以及生物學(xué)特性有關(guān)，可作為判斷預(yù)后的指標(biāo)。同時(shí)，白血病細(xì)胞株的CD87表達(dá)，隨著時(shí)間的增加，其表達(dá)均呈現(xiàn)增加的趨勢，這可能與CD87表達(dá)使白血病細(xì)胞表面纖溶活性增高的原因主要與其浸潤能力有關(guān)，其高表達(dá)是髓系細(xì)胞成熟與分化較好的標(biāo)志。但是研究中亦發(fā)現(xiàn)，PMA誘導(dǎo)前K562細(xì)胞未檢出CD87表達(dá)，但RT-PCR檢測其mRNA有少量表達(dá)，推測這可能與誘導(dǎo)前僅少量表達(dá)于胞質(zhì)內(nèi)有關(guān)。

綜上，CD87可用于急性髓性白血病的診斷及預(yù)后判斷中，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。而CD87亦參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)，但其機(jī)制，尚不清楚，這也為今后的研究指明了方向。

4 參考文獻(xiàn)

1柳 嘉，趙松穎，郭慧梅，等.uPA和uPAR在老年急性髓系白血病中治療前后表達(dá)的變化〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；33(8):1774-5.

2張 麗，梁英民.白血病干細(xì)胞的分子調(diào)控〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009;9(10): 1998-2001.

3張連成.TEM8與uPA的相互作用及其生物學(xué)意義研究〔D〕.中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士畢業(yè)論文,2013.

4劉寶芹，邵雪齋，方艷秋.急性髓系白血病中uPA和uPAR的表達(dá)及意義〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)， 2011;15(5)：891-2.

5賈國榮，李志芹.急性髓系白血病患者治療前后T淋巴細(xì)胞亞群測定的臨床意義〔J〕.標(biāo)記免疫分析與臨床， 2011;18(2)：76-9.