李現(xiàn)東 韓紀昌 李 磊 賈宗嶺 李紅兵 吳雪雁

(河南大學淮河醫(yī)院呼吸科,河南 開封 475000)

慢性阻塞性肺病(COPD)的發(fā)病機制尚未完全清楚，COPD動物模型的，非纖毛上皮細胞及其分泌蛋白的變化越來越引起人們的重視。非纖毛上皮細胞,也稱Clara細胞,主要分布于細支氣管,具有多種功能。Clara細胞是支氣管上皮損傷修復的祖細胞，是細支氣管上皮的前體細胞,可代謝細胞色素P-450單氨氧化酶,分泌表面活性物質。Clara細胞分泌的一種10 kD蛋白(CC10),近年來被認為在小氣道的防御機制中起重要作用,如可結合多氯聯(lián)苯〔1〕;具有抑制磷脂酶A2、抗蛋白酶活性作用〔2～4〕。本實驗模擬吸煙導致人COPD發(fā)生的病理生理過程,采用煙草霧吸入誘導COPD大鼠模型,觀察COPD發(fā)病過程中Clara細胞超微結構變化及小氣道CC10表達的變化,并測定氣道阻力及呼吸系統(tǒng)總順應性,進而探討Clara細胞在COPD發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1COPD大鼠模型的制作 自制有機玻璃染毒箱,70 cm×60 cm×60 cm,上方設有一直徑1.2 cm的通氣孔;吸煙小室大小約3 cm×1.5 cm×1.5 cm,每次吸煙時同時將2支點燃的香煙的過濾嘴部分與吸煙小室相連,煙霧經(jīng)改良的注射器裝置由吸煙小室吸出后注入染毒箱內。香煙采用廣東中煙集團生產(chǎn)的硬盒雙喜牌過濾嘴香煙,含焦油13 mg,尼古丁1.3 mg，一氧化碳1.4 mg。大鼠每日吸煙3次,每次持續(xù)吸入新鮮的香煙煙霧30 min,兩次吸煙間隔4 h。第1天每次吸煙6支,第2、3天每次吸煙8支,第3天以后每次吸氧10支。

1.2實驗動物及分組 雄性Wistar大鼠36只,體重(250±20)g,由新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心提供,根據(jù)實驗將大鼠隨機分為3組,每組各12只:分別設為：A組：大鼠吸煙至第3周末處死，B組：大鼠吸煙至第6周末處死，C組,大鼠不吸煙,飼養(yǎng)至7 w末處死。

1.3呼吸功能測定 采用小動物呼吸功能測定儀(北京宣武醫(yī)院研制),測定氣道阻力(呼氣時)及呼吸系統(tǒng)總順應性。

1.4標本制作及免疫組化染色 呼吸功能測定結束后將所有大鼠行腹主動脈放血處死。取大鼠右下肺組織固定于10%福爾馬林,進行石蠟切片,部分行常規(guī)HE染色,另有一部分標本經(jīng)常規(guī)APES處理后進行免疫組化染色,免疫組化染色使用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶(S-P)方法。試劑采用廣州達安基因有限公司生產(chǎn)的SP-9706試劑盒。免疫染色陰性對照采用PBS代替一抗。取右上肺新鮮組織立即固定于2.5%戊二醛溶液,按電鏡常規(guī)行標本制備,半薄切片定位終末細支氣管后做超薄切片,醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染色,JEM-100CXⅡ型透射電鏡觀察。

1.5免疫組化染色判定 每例選擇4個終末或呼吸性細支氣管,計數(shù)CC10陽性細胞占支氣管上皮細胞的百分率,400倍鏡下觀察。CC10陽性細胞質頂端呈黃色→棕黃色,根據(jù)著色程度將陽性細胞染色強度定為3級，+、、分別積1、2、3分。

1.6統(tǒng)計學方法 采用秩和檢驗。

2 結 果

2.1各組呼吸功能及CC10表達的比較 見表1。A、B、C三組氣道阻力、肺順應性、CC10阻性細胞百分比及積分均有顯著差異(P<0.05)。

表1 各組呼吸功能及CC10表達的比較±s，n=12)

2.2Clara細胞的分布 免疫組化顯示，Clara細胞主要分布于終末細支氣管和呼吸性細支氣管(表2)。

表2 各組大鼠的Clara細胞分布及細胞數(shù)±s)

2.3光鏡觀察 C組:氣管、支氣管及肺泡結構正常。A組:支氣管上皮增生,部分支氣管上皮呈復層排列,支氣管壁出現(xiàn)“套袖狀”單核細胞浸潤,肺泡囊擴張。吸B組:大鼠支氣管上皮細胞明顯脫落,肺泡結構紊亂,部分肺泡壁變薄、斷裂、呈飄帶樣改變,肺泡融合、肺泡腔擴大。

2.4電鏡觀察 C組:大部分細胞呈橢圓形突入管腔,表面有短小微絨毛,為Clara細胞,占細支氣管上皮細胞的62%。Clara細胞胞質內見多量有膜包繞的顆粒,呈圓形或橢圓形,電子密度均勻,部分電子密度較低的顆粒周邊有空暈或致密核心。少數(shù)顆粒見指紋狀結構。個別顆粒呈胞吐狀態(tài)。Clara細胞內有多量滑面內質網(wǎng)及較多線粒體。纖毛細胞較少,纖毛排列整齊。A組大鼠: Clara細胞占細支氣管上皮細胞的47%,胞質內的顆粒減少,含低電子密度顆粒的Clara細胞較多。B組大鼠:Clara細胞占細支氣管上皮細胞的41%,部分細胞結構模糊,滑面內質網(wǎng)擴張。纖毛細胞增多,纖毛紊亂、脫落,變窄的管腔內充以脫落纖毛及細胞碎片。

2.5氣道上皮細胞CC10陽性率與呼吸功能相關性 氣道上皮細胞CC10陽性率與氣道阻力呈負相關(R=-0.694，P<0.01),與動態(tài)呼吸系統(tǒng)總順應性呈正相關(R=0.732，P<0.01)。

3 討 論

COPD特點是小氣道阻力增高、肺動態(tài)順應性下降，其發(fā)病機制尚未完全清楚，目前是呼吸系統(tǒng)疾病研究領域的熱點之一〔5～8〕。近來的研究發(fā)現(xiàn),短期吸入臭氧(2 w)導致Clara細胞損傷、壞死,長期吸入臭氧(20個月)導致大鼠終末細支氣管Clara細胞數(shù)量增加、Clara細胞顆粒體積增大、胞質內CC10含量增加,該變化被認為是氣道上皮細胞對氧化劑耐受性的表現(xiàn)〔2,9～11〕。臨床研究發(fā)現(xiàn),吸煙者氣道上皮細胞中Clara細胞數(shù)量減少,末梢血CC10含量下降。以上研究提示Clara細胞在COPD發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用〔12,13〕。

本研究結果提示大鼠長期吸煙可使大鼠出現(xiàn)慢性支氣管炎、肺氣腫的病理改變,氣道阻力增加、動態(tài)呼吸系統(tǒng)總順應性下降;吸煙導致Clara細胞受損,其數(shù)量減少,CC10表達下降,電鏡觀察顯示其超微結構也發(fā)生了變化,吸煙3 w出現(xiàn)氣道上皮CC10表達下降,電鏡觀察顯示含低電子密度顆粒的Clara細胞較多,此種變化的意義尚不清楚。上皮細胞的損傷脫落是COPD患者氣道的一個重要病理改變,氣道上皮損傷修復延遲參與氣道炎癥過程。在氣道上皮損傷修復過程中,局部合成較多的細胞因子,促進氣道炎癥與氣道重構。本研究提示Clara細胞在參與COPD氣道炎癥上皮損傷修復過程中,其CC10分泌減少;同時,Clara細胞減少導致上皮損傷修復延遲,成纖維細胞遷徙至上皮下發(fā)揮替代修復作用,促進氣道重構。

本研究結果提示COPD時CC10降低削弱了對PLA2的抑制,促進LT的產(chǎn)生,參與氣道重構。由于Clara細胞參與表面活性物質合成,COPD大鼠Clara細胞數(shù)量減少、氣道上皮細胞CC10表達下降,可導致小氣道內表面活性物質減少、局部抗炎作用減弱,引起氣道阻力增高、動態(tài)呼吸系統(tǒng)總順應性下降,最終導致了COPD的發(fā)生〔14～16〕。

本研究通過煙霧吸入誘導的COPD大鼠模型,證實了Clara細胞及其分泌蛋白與COPD病變密切相關。但考慮到本研究中大鼠例數(shù)較少,觀察時間較短，得出的結論尚不夠客觀，所以應加大樣本量再進行進一步的研究。

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