容瓊文 蘇慶杰 陳志斌 王淑榮 蔡美華 王 埮 陳 蓉

(海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內科，海南 ?？?570102)

神經(jīng)元凋亡是腦缺血損傷過程中神經(jīng)元死亡的一種主要形式，尤其是在遲發(fā)性神經(jīng)元死亡中作用顯著。目前已知調控細胞凋亡的三條主要的信號轉導通路為線粒體通路、死亡受體通路和內質網(wǎng)通路〔1〕。線粒體膜通透性轉換孔(MPTP)是細胞凋亡線粒體途徑的樞紐。在細胞凋亡中，MPTP起到重要作用，神經(jīng)元缺血/再灌注(I/R)損傷后，神經(jīng)元內線粒體膜損傷，通透性增加，導致細胞色素C(CytC)從線粒體釋放入胞質，引起一系列級聯(lián)反應，導致細胞凋亡〔2〕。本研究觀察神經(jīng)細胞擬明確環(huán)孢素A(CsA)是否具有抗神經(jīng)細胞缺氧性損傷的作用，探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 出生24 h內雄性SD大鼠，由海南醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.1.2主要試劑 CsA購自Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清、0.25%胰蛋白酶、Neuronbasal培養(yǎng)液、B-27添加劑購自GIBCO公司；神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)購自武漢博士德生物公司；L-多聚賴氨酸、阿糖胞苷(Ara-c)購自Sigma 公司。細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、兔單克隆Caspase-3激活型抗體購自碧云天公司；CytC試劑盒購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.1.3主要儀器 熒光顯微鏡、Dynatech MR 4000型ELISA讀數(shù)儀、倒置相差顯微鏡：OLYMPUS公司(日本)；流式細胞儀：FACSCLSR，Becton-Dickton(美國)。

1.2實驗方法

1.2.1SD大鼠大腦皮層神經(jīng)細胞的培養(yǎng)與鑒定 取出生24 h的SD大鼠，低溫麻醉后75%乙醇消毒，無菌條件下取腦組織，將腦組織放置于低溫無菌PBS液中，剪除腦膜、血管，低溫PBS液沖洗3次，剪成1 mm的碎塊，加入0.25%胰酶在37℃溫箱內消化10 min，之后加入完全培養(yǎng)液終止消化，滴管吹打混勻后800 r/min離心6 min，棄上清，再加完全培養(yǎng)液6 ml，過200目篩網(wǎng)，1 000 r/min離心6 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)液重新懸浮細胞，靜置15 min，按1×106/ml的密度接種于細胞培養(yǎng)瓶內(培養(yǎng)瓶預先給予多聚賴氨酸包被)，放置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換為維持培養(yǎng)液，第3天開始更換為含有阿糖胞苷的維持培養(yǎng)液繼續(xù)作用48 h，然后再換回維持培養(yǎng)液，之后每次換半量。接種第7天可見神經(jīng)元突起連接成網(wǎng)，使用標記有綠色免疫熒光的NSE鑒定神經(jīng)元。

1.2.2實驗分組 原代神經(jīng)元培養(yǎng)至7 d，分組：(1)對照組；(2)I/R組；(3)I/R+CsA組(按CsA濃度不同又分為4個亞組，分別為：CsA1組，細胞培養(yǎng)體系中加入1 μmol/L CsA；CsA5組，細胞培養(yǎng)體系中加入5 μmol/L CsA；CsA10組，細胞培養(yǎng)體系中加入10 μmol/L CsA；CsA20組，細胞培養(yǎng)體系中加入20 μmol/L CsA，各亞組的CsA均在造I/R模型前2 h加入)。

1.2.3大鼠神經(jīng)細胞體外模擬I/R模型的建立 取培養(yǎng)7 d的神經(jīng)元，換入無糖Earles液，將神經(jīng)元培養(yǎng)瓶置于含有95%N2和5%CO2的混合氣體的缺氧罐內，置于培養(yǎng)箱內密閉6 h，取出神經(jīng)元培養(yǎng)瓶，換入維持培養(yǎng)液，放回37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗〔3～5〕。

1.2.4MTT比色法檢測CsA對I/R神經(jīng)細胞活力的影響 取上述各組細胞，調整細胞計數(shù)為1×106/ml，按每孔100 μl接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔加入MTT 15 μl(5 mg/dl)，37℃孵育4 h，鏡下觀察形成紫色針狀結晶，棄去上清，每孔加入DMSO 100 μl，室溫下放置10 min。待鏡下觀察紫色結晶全部溶解后，以Dynatech MR 4000型ELISA讀數(shù)儀測定MTT吸光度值，檢測波長為570 nm。

1.2.5Annexin V -FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率 收集各組細胞，操作方法參照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行，上機檢測細胞凋亡率。

1.2.6Western印跡檢測各組胞質CytC及活性Caspase-3蛋白表達 取培養(yǎng)的各組細胞，提取胞質蛋白(參照細胞核蛋白與細胞質蛋白抽提試劑盒說明書進行)。提取后行蛋白定量，取10 μg樣品，加入等體積上樣緩沖液混勻，100℃煮2 min，以10%SDS-PAGE凝膠電泳分離，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，室溫封閉1 h后加入一抗4℃過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫1 h，洗滌，顯色，曝光。

2 結 果

2.1原代大鼠皮層神經(jīng)細胞的培養(yǎng)與鑒定 出生24 h的SD大鼠皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)至第7天，可見神經(jīng)元胞體圓滿，胞核顯示明顯，細胞突起長，相互間連接成網(wǎng)(圖1)。免疫熒光染色顯示神經(jīng)元胞質及突起呈NSE陽性綠色熒光(圖2)。

圖1 培養(yǎng)至7 d的神經(jīng)元(×200)圖2 神經(jīng)細胞免疫熒光鑒定

圖3 Westrn 印跡檢測各組CytC及活性Caspase3蛋白表達

2.2CsA對I/R后神經(jīng)元的作用 對照組細胞在未加任何干預的情況下，其在570 nm處的光密度值(OD值)為0.849±0.034；I/R組的OD值明顯降低，為0.648±0.030(P<0.01)；I/R+CsA各亞組均可見OD值升高，CsA1、5、10、20組分別為0.684±0.008、0.731±0.004、0.780±0.009、0.787±0.004，與I/R組差異顯著(P<0.05，P<0.01)。

2.3聯(lián)合Annexin V-FITC和PI染色檢測各組細胞凋亡率 正常培養(yǎng)神經(jīng)元的凋亡率為4.8%,I/R組為20.1%，與對照組相比差異明顯(P<0.01)；CsA1組為17.51%，CsA5組為13.25%，CsA10組為10.63%，CsA20組為6.78%，各CsA組與I/R組相比凋亡率均減少(P<0.05)。

2.4Western 印跡法檢測各組神經(jīng)元CytC及活性Caspase-3蛋白表達 對照組神經(jīng)元CytC及活性Caspase-3蛋白有少量表達，經(jīng)I/R處理后兩者表達均明顯增多，分別為對照組的1.3及1.5倍(P<0.05)；而預先用CsA干預的各組細胞，胞質CytC及活性Caspase-3蛋白的量隨著濃度的增高逐漸減少(P<0.05)，見圖3。

3 討 論

線粒體是重要的細胞器，是細胞生產能量的重要場所，氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)、能量平衡等過程均在線粒體中進行。維持線粒體功能的必要條件是線粒體膜的通透性和流動性〔6〕。

在維持線粒體功能中，線粒體通透性轉換起關鍵作用，是掌控線粒體內外信息交流的樞紐,其是通過MPTP實現(xiàn)的。MPTP主要系由線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道(VDAC)、線粒體內膜的腺苷酸轉運酶(ANT)和線粒體基質的CsA受體D(CyP-D)組成的蛋白復合體，位于線粒體內外膜之間〔7〕。此外,某些線粒體膜蛋白也可能與此通道構成有關，如抗凋亡蛋白Bcl-2和苯二氮卓類受體、線粒體肌酸激酶等〔8〕。

線粒體在生理狀態(tài)下為細胞提供能量主要依靠線粒體內外膜之間保持一定的電化學勢能，促使氧化磷酸化合成ATP。正常狀態(tài)下，MPTP處于關閉狀態(tài)，線粒體內膜僅選擇性地通過某些代謝底物和離子，對其他物質都沒有通透性，線粒體外膜允許分子量10 kD以下的呼吸鏈底物自由通過，這就有利于在線粒體內外產生電勢差，形成穩(wěn)定的線粒體膜電位。

在缺血缺氧的應激條件下，線粒體內膜可自由通過分子量小于1.5 kD的分子物質，升高線粒體基質滲透壓，出現(xiàn)基質腫脹，線粒體外膜損傷，線粒體膜電位失衡，MPTP開放。同時，細胞Ca2+轉運異常，引起線粒體內Ca2+超載,Ca2+通過與MPTP的結合位點,引起MPTP開放,導致線粒體內膜電位喪失,線粒體腫脹、外膜破裂，兩者發(fā)生的結果使線粒體外膜受到破壞，導致位于線粒體膜間隙的CytC和AIF等線粒體凋亡因子釋放。其次，線粒體內膜允許質子自由通過，這使氧化磷酸化過程解耦聯(lián),ATP水解大于合成。同時，線粒體膜電位的破壞也加速線粒體能量耗竭。當MPTP開放后，不足以削弱整個細胞產生ATP。因此，CytC和AIF等線粒體凋亡因子釋放以及ATP的變化，使Caspases-9前蛋白被激活成Caspases-9活性形式,后者繼而激活Caspase-3,從而導致細胞凋亡〔9,10〕。

本實驗中，大鼠神經(jīng)細胞I/R后，細胞凋亡率明顯升高，同時胞質內CytC蛋白含量增高及活性Caspase-3表達升高。CsA抑制MPTP的開放是通過和CyP-D結合〔11〕，從而阻止線粒體內容物釋放，使細胞凋亡延緩。CsA能明顯地減輕心、肝、腦、腎等臟器I/R過程中細胞凋亡的發(fā)生〔12〕。目前有關CsA對體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞I/R后凋亡的影響尚無報道，本實驗結果表明，CsA各亞組與I/R組相比，細胞凋亡率明顯下降,胞質內CytC蛋白及活性Caspase-3表達顯著降低，證明CsA對體外培養(yǎng)的神經(jīng)細胞I/R損傷有保護作用，該作用可能是源于CsA對神經(jīng)細胞MPTP開放的抑制作用。

4 參考文獻

1Arden N,Majors BS,Ahn SH,etal.Inhibiting the apoptosis pathway using MDM2 in mammalian cell cultures〔J〕.Biotechnol Bioeng,2007;97(3):601-14.

2Kim JS,He L,Lemasters JJ.Mitochondrial permeability transition: a common pathway to necrosis and apoptosis〔J〕〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2003;304(3):463-70.

3Goldberg MP,Hoi DW. Combined oxygen and glucose deprivation in cortical cell culture:calcium-dependent and calcium-independent mechanisms of neuronal injury〔J〕. Neuronscience,1993;13: 3510-24.

4Meloni BP,Majda BT,Knuckey NW. Establishment of neuronal in vitro models of ischemia in 96-well microtiter strip-plates that result in acute progressive and delayed neuronal death〔J〕. Neuroscience,2001;108(1):17-26.

5司徒鎮(zhèn)強,吳軍正.細胞培養(yǎng)〔M〕.第2版.西安:世界圖書出版公司，2007:200-1.

6江時森,程訓民.線粒體通透性轉換孔在糖尿病心肌病中的作用〔J〕.解放軍醫(yī)學雜志,2010;35(7):785-7.

7Javadov S,Karmazyn M.Mitochondrial permeability transition pore opening as an endpoint to initiate cell death and as a putative target for cardioprotection〔J〕.Cell Physiol Biochem，2007,20(1-4):1-22.

8Krestinina OV,Grachev DE,Odinokova IV,etal.Effect of peripheral benzodiazepine receptor(PBR/TSPO) ligands on opening of Ca2+-induced pore and phosphorylation of 3.5-kDa polypeptide in rat brain mitochondria〔J〕.Biochemistry (Mosc)，2009;74(4):421-9.

9Bernardi P,Krauskopf A,Basso E,etal.The mitochondrial permeability transition from in vitro artifact to disease target〔J〕.FEBS J，2006;273(10):2077-99.

10Nakagawa T,Shimizu S ,Watanabe T,etal. Cyclophilin D dependent mitochondrial permeability transition regulates som e necrotic but not apoptotic cell death〔J〕. Nature,2005;434(7033):652-8.

11Halestrap AP.Mitochondrial calcium in health and disease〔J〕.Biochim Biophys Acta，2009;1787(11):1289-90.

12Xie JR,Yu LN. Cardioprotective effects of cyclosporine A in an in vivo model of myocardial ischemia and reperfusion〔J〕.Acta Anaesthesiol Scand,2007;51(7):909-13.