袁 芳 劉 濤 馬 龍

(新疆醫(yī)科大學，新疆 烏魯木齊 830011)

中藥及保健功能性食物預防和治療阿爾茨海默病(AD)的作用日益受到重視〔1〕。國內(nèi)外研究顯示，葡萄提取物能預防AD，對原花青素、白藜蘆醇等葡萄提取物的抗癡呆作用報道較多，但未見對葡萄提取的三萜類物質(zhì)研究〔2～4〕。瑣瑣葡萄為葡萄科葡萄屬植物山葡萄，我國主產(chǎn)于新疆吐魯番、和田、鄯善等地，是醫(yī)藥文獻如《神農(nóng)本草經(jīng)》、《維吾爾藥志》等所記載的藥用葡萄品種之一。齊墩果酸(OA)是一種五環(huán)三萜類化合物，在瑣瑣葡萄提取的總三萜中的平均含量為65.52%。本研究通過建立AD大鼠模型，發(fā)現(xiàn)瑣瑣葡萄提取的總三萜具有抗AD作用〔5〕。本研究利用Aβ25～35誘導PC12細胞，制備具有擬AD樣病理變化的體外細胞模型，研究OA對神經(jīng)細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1藥品試劑與儀器 瑣瑣葡萄購自新疆維吾爾自治區(qū)吐魯番維藥市場，新疆藥物研究所鑒定。課題組提取OA，二甲亞砜(DMSO)溶解，0.22 μm尼龍濾膜過濾除菌，-20℃避光保存，臨用時用完全培養(yǎng)基稀釋，DMSO濃度低于1‰。DMEM培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；Aβ25～35(Sigma公司)；CCK-8檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物研究所)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(BioVision)；Trizol(Invitrogen)；逆轉錄試劑盒(TaKaRa)，熒光定量(Invitrogen)。垂直流超凈化臺(美國Thermo公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，全自動酶標儀(美國Bio-Rad公司)，流式細胞儀(BD LSRⅡ)，倒置熒光顯微鏡(LEICA DFC490，德國)，實時PCR儀(7700型，美國ABI公司)。

1.2Aβ25～35誘導 PC12 細胞損傷模型的建立 PC12細胞(高分化)購自中國科學院上海細胞生物學研究所。細胞常規(guī)培養(yǎng)，DMEM高糖培養(yǎng)基含10%滅活胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，置37℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱，隔天換液，3～4 d傳代。取對數(shù)生長期的PC12細胞，計數(shù)后5×104/ml接種于96孔板，每孔100 μl，培養(yǎng)至貼壁后，分別加入0、10、20、30、40 μmol/L的Aβ25～35(1 mmol/L的Aβ25～35置于37℃老化7 d，臨用前稀釋)，在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測細胞的存活率。

1.3CCK-8試劑盒測定細胞存活率 對數(shù)生長期的PC12細胞5×104/ml接種于96孔板，保護組加入OA，終濃度為20、40、80 μg/ml，預處理4 h后，除對照組外加入Aβ25～35，使之終濃度為20 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK-8 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標儀450 nm測定吸光度，計算PC12細胞存活率。

1.4LDH檢測 Aβ25～35誘導24 h后，分別收集各組細胞上清液，按試劑盒說明書操作，計算各組細胞上清液LDH活性。

1.5SOD、MDA檢測 按上述方法收集各組細胞上清液，按試劑盒說明書操作，分光光度計測定吸光度，每組設5個復孔，實驗重復3次。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞接種于6孔板，按上述方法分組并培養(yǎng)細胞，將各組的細胞消化后收集，1 000 r/min離心5 min，用冷DMEM洗滌2次，結合緩沖液中重懸成單細胞懸液，密度為1×106/ml，室溫下加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染料，輕輕振蕩、混勻，室溫下避光孵育15 min，流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.7實時熒光定量PCR檢測NF-κB p65基因表達 細胞接種6孔板，按上述方法分組培養(yǎng)細胞，Trizol法提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計分析RNA濃度和純度。逆轉錄合成cDNA。cDNA 加入熒光定量PCR反應體系。根據(jù)GenBank序列，引物和探針設計軟件Primer 5.0設計引物序列。所用的引物及內(nèi)參β-actin引物由鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。數(shù)據(jù)采用雙標準曲線法處理，樣本的相對定量=目的基因含量/內(nèi)參基因含量，計算待測組目的基因相對于對照組的表達差異倍數(shù)。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結 果

2.1Aβ25～35對PC12細胞活性的影響 終濃度分別為10、20、30、40 μmol/L的Aβ25～35與PC12細胞作用24 h后，與對照組(100%)細胞比較，細胞存活率逐漸降低，其IC50約為20 μmol/L。本課題后續(xù)實驗采用20 μmol/L的Aβ25～35作用PC12細胞24 h制備AD細胞模型。

2.2OA對PC12細胞存活率的影響 與對照組比較，模型組細胞生長受到抑制，細胞存活率下降為68.03%(P<0.01)；與模型組相比，OA保護組細胞存活率有明顯增加(P<0.05)。見表1。

2.3OA對Aβ25～35誘導的PC12細胞LDH、SOD、MDA的影響 與對照組比較，模型組細胞的LDH活性明顯增加、SOD活性明顯下降、MDA含量增高(P<0.01)；與模型組相比，OA組細胞LDH活性明顯降低、SOD活性增加、MDA含量降低(P<0.01)。見表2。

2.4OA對PC12細胞凋亡率的影響 對照組細胞凋亡率(4.58%)明顯低于模型組凋亡率(35.18%)(P<0.01)；與模型組相比，80、40、20 μg/ml OA組凋亡率(8.88%、12.94%和15.15%)均明顯下降(P<0.05)。

2.5NF-κB p65 mRNA表達 與對照組相比，模型組NF-κB p65表達上調(diào)(3.53±0.51 vs 1.00±0.00，P<0.01)；與模型組相比，80、40、20 μg/ml OA保護組NF-κB p65表達降低(0.99±0.07、1.73±0.02、0.60±0.19，P<0.01)。

表1 OA對Aβ25～35誘導的PC12損傷的影響±s,n=4)

表2 OA對Aβ25～35誘導的PC12細胞SOD、MDA活性的影響±s,n=5)

3 討 論

Aβ分子中決定其毒性的主要片段在25～35，常用于誘導AD的體外細胞模型〔6，7〕。PC12細胞為大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤克隆化的細胞株，1976年由Greene等建立，具有較典型的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞特性，已廣泛用作神經(jīng)細胞體外模型〔8，9〕。本研究采用20 μmol/L Aβ25～35作用于PC12細胞24 h，結果顯示模型組細胞存活率下降至58%，細胞凋亡率顯著增加，表明此模型可以作為評價OA神經(jīng)保護效果的神經(jīng)損傷體外模型。

CCK-8試劑盒是檢測細胞增殖、細胞毒性的試劑盒，為MTT法的替代方法，具有靈敏度高、數(shù)據(jù)可靠、重現(xiàn)性好的優(yōu)點。LDH是細胞內(nèi)標志酶，當細胞膜的完整性遭到破壞，胞質(zhì)中LDH大量釋放到細胞外，其漏出量與細胞受損程度相平行。因此，它們是檢測細胞功能狀態(tài)、受損程度和存活數(shù)量的重要指標。本實驗結果表明OA對神經(jīng)細胞的損傷具有保護作用。

在正常情況下，機體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，Aβ可通過誘導產(chǎn)生氧自由基使腦細胞膜系統(tǒng)的脂質(zhì)和蛋白被氧化修飾，使活性氧增加，促進氧化反應和過氧化物形成，誘導氧化應激損傷，降低抗氧化作用，自由基損傷是Aβ發(fā)揮細胞毒性的方式之一。氧自由基也可促進生成Aβ，二者具有相互促進效應。神經(jīng)細胞丟失是AD的一個重要特征，細胞凋亡是丟失的重要前提，Aβ能引起神經(jīng)細胞的凋亡。SOD和MDA是反映自由基損傷最具有代表性指標。本實驗結果提示細胞損傷與脂質(zhì)過氧化有關，OA可能通過抗氧化、抗凋亡起到對神經(jīng)細胞損傷的保護作用。

核因子-κB(NF-κB)是具有多向轉錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，NF-κB/IκB信號轉導途徑被認為是炎癥及凋亡信號轉導的關鍵。Aβ可以直接或間接產(chǎn)生氧自由基(ROS)，ROS可激活神經(jīng)元內(nèi)的 NF-κB，進而通過炎癥反應、氧化應激和細胞的凋亡等多途徑參與 AD 的發(fā)病過程〔10〕。本研究提示Aβ25～35通過激活NF-κB信號通路，誘導NF-κBp65 mRNA過度表達，引起細胞凋亡；OA可降低Aβ誘導的NF-κB表達，抑制細胞凋亡，保護神經(jīng)細胞。

本研究表明OA對AD細胞模型具有保護作用，通過其抗氧化活性增強清除氧自由基能力，減少脂質(zhì)過氧化反應，調(diào)節(jié)NF-κBp65 mRNA的表達抑制神經(jīng)細胞凋亡。OA作為一種天然化合物，不僅毒副作用低，而且可通過抗氧化、抑制細胞凋亡多方面保護神經(jīng)細胞損傷，具有開發(fā)為抗癡呆、抗衰老藥物前景，本實驗為維藥瑣瑣葡萄防治AD等神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供科學依據(jù)，為促進維藥的理論發(fā)展，同時也為充分利用新疆豐富的葡萄資源，研發(fā)安全、有效、價廉AD民族新藥提供新思路。

4 參考文獻

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