張圣福 黃元丁 王 濤

(重慶市口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)研究中心 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，重慶 401147)

牙周膜成纖維細(xì)胞(PDLFs)經(jīng)證實(shí)具有異質(zhì)性，除了具有成纖維性能，而且可以向成牙骨質(zhì)和成骨方向分化，已經(jīng)成為牙周組織工程首選的種子細(xì)胞〔1〕。三維鈦網(wǎng)支架(TW)是由直徑50 μm鈦絲編織而成的圓盤狀支架，高度2～10 mm，平均孔徑200 μm，孔隙率87%，Dong等學(xué)者證實(shí)此支架具有良好的生物相容性和生物安全性，較傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)環(huán)境能有效促進(jìn)細(xì)胞和組織的附著，增殖，能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化〔2〕。TW在骨組織工程和牙周組織再生工程中具有良好的應(yīng)用前景〔3〕，本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)PDLFs，通過與TW支架材料三維培養(yǎng)，檢測(cè)TW對(duì)其附著、增殖及分化的影響，為牙周組織工程種子細(xì)胞及支架材料提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1周歲beagle犬，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(渝)2007-0001〕。

1.2主要試劑和儀器 胎牛血清(Gbico)，DMEM：F12培養(yǎng)基(HyClone)，胰蛋白酶、I型膠原酶(Sigma)，青霉素、鏈霉素(HyClone)，地塞米松、維生素C、β-磷酸甘油鈉(Sigma)，抗波形蛋白抗體(Abcam)，抗角蛋白抗體(LSBio)，噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒(碧云天)，AKP檢測(cè)試劑盒(南京建成)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)、超凈工作臺(tái)(蘇州醫(yī)療設(shè)備廠)、光學(xué)顯微鏡(Olympus)、倒置相差顯微鏡(Nikon)，透射電鏡、掃描電鏡(Hitachi)。

1.3方法 酶消化組織塊法體外原代培養(yǎng)犬PDLFs〔4〕，3%戊巴比妥鈉按腹腔注射麻醉1周歲年齡beagle犬(1 ml/kg)，2%利多卡因局部浸潤麻醉拔除上下前牙約10顆，冠向下，根朝上，用預(yù)冷無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，含200 U/ml青霉素、200 U/ml鏈霉素)反復(fù)沖洗血污3次以上，轉(zhuǎn)入生物安全柜內(nèi)，用含有雙抗的無菌PBS再次反復(fù)沖洗離體牙，用刀片刮取牙根中1/3的牙周膜組織，勿用眼科剪分，避免再次損失組織塊。將組織塊移入5 ml離心管中，加入0.1%膠原酶和0.25%胰蛋白酶各0.5 ml，37℃消化30 min，每5 min振蕩1次，當(dāng)肉眼觀察到培養(yǎng)液略混濁，顯微鏡下見組織塊松散時(shí)，離心(800～1 000 r/min，5 min)，棄上清液，用含20%胎牛血清及雙抗(100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)的DEME和F12(1∶1)培養(yǎng)基漂洗1次后棄上清液，收集組織塊，將組織塊平鋪于50 ml塑料培養(yǎng)瓶底，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，底部朝上，向內(nèi)加入上述完全培養(yǎng)基1 ml，置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h，使組織塊貼壁，再復(fù)原培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，3 d后更換培養(yǎng)基，操作時(shí)動(dòng)作輕柔，避免組織塊脫離瓶底。取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu) 取第3代細(xì)胞，PBS漂洗，細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，離心，稀釋制成107/ml高濃度細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液加入做好的瓊脂管中(eppendorf管中加入2%的瓊脂，中間用牙簽弄個(gè)小洞)，離心后，切開eppendorf管，切去多余的瓊脂，留下包埋細(xì)胞的瓊脂塊，用2.5%的戊二醛、1%的鋨酸雙固定，梯度酒精脫水、滲透、包埋、聚合、超薄切片，染色，觀察。

1.5細(xì)胞組織來源鑒定 取第3代細(xì)胞，0.25%胰酶消化，離心，制作單層細(xì)胞爬片，用酶聯(lián)免疫(SP)法，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色進(jìn)行波形蛋白和角蛋白抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色，設(shè)置空白、陰性對(duì)照。

1.6礦化結(jié)節(jié)實(shí)驗(yàn)鑒定 取第3代細(xì)胞消化后接種六孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、100 μg/ml維生素C、10 nmol/L地塞米松的完全培養(yǎng)基，約3 w出現(xiàn)白色的礦化結(jié)節(jié)，PBS漂洗，95%乙醇固定10 min，蒸餾水沖洗數(shù)次，0.1%茜素紅(Tris-HCl pH8.3)染色30 min，PBS沖洗數(shù)次，自然干燥，照相。

1.7TW對(duì)犬PDLFs的生物學(xué)行為的影響 取6只TW放在10 ml離心管底部，用常用細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)液4 ml，反復(fù)吹打，靜置2 h，取出預(yù)濕過的鈦網(wǎng)放入96孔板，取第3代細(xì)胞消化離心稀釋制成濃度104/ml細(xì)胞懸液，慢慢滴入TW內(nèi)部，24 h后取出TW放入新96孔板，常規(guī)培養(yǎng)。取培養(yǎng)1 w后TW行戊二醛固定、脫水、置換、臨界點(diǎn)干燥、噴金、掃描電鏡觀察細(xì)胞附著增殖。取12只預(yù)濕過的TW放入96孔板為實(shí)驗(yàn)組，取另12孔位對(duì)照組，再取12孔為空白組(只加入培養(yǎng)液)，取第3代細(xì)胞制104/ml成細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組每孔反復(fù)滴入TW 200 μl，分別培養(yǎng)2、4、6、8 d后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，取出鈦網(wǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光度值，根據(jù)各時(shí)間點(diǎn)，各組數(shù)據(jù)均值繪制柱狀圖。實(shí)驗(yàn)組取12只預(yù)濕過的TW放入24孔板的，取第3代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液反復(fù)滴入TW各1 ml，常規(guī)復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)照組取第3代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液滴入12孔，各1 ml，采用含礦化誘導(dǎo)液的復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)，兩組細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)24、48、72 h后消化，離心，細(xì)胞裂解液裂解，離心取上清液，用堿性磷酸酶(AKP)試劑盒檢測(cè)AKP含量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)采用方差分析，t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定 組織塊經(jīng)酶消化接種5～7 d，在倒置顯微鏡下可見梭形細(xì)胞從組織塊邊緣呈發(fā)射狀游出，約2 w可將原代細(xì)胞消化傳代(圖1A)。經(jīng)傳代的細(xì)胞以長梭形和星形為主，也有多角形，胞體豐滿，有2～4個(gè)梭形細(xì)胞突起，胞質(zhì)均勻，核圓形或卵圓形，核仁清晰，呈較典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)；細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶時(shí)呈放射狀、漩渦狀排列(圖1B)。透射電鏡下PDLFs有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、核糖體；顯示細(xì)胞為處于生長旺盛的PDLFs(圖1C)。光鏡下觀察免疫細(xì)胞化學(xué)染色波形絲蛋白抗體呈陽性(圖1D)，角蛋白陰性(圖1E)，證明細(xì)胞來源于中胚層，無上皮細(xì)胞來源混雜。細(xì)胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)3 w后出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)，茜素紅染色陽性，證明經(jīng)培養(yǎng)的PDLFs具有向硬組織分化的能力(圖1F)。PDLFs在材料表面附著伸展良好，主要呈長梭形，細(xì)胞生長密集處伸出突起相互連接。

A

B

C

D

E

F

2.2PDLFs增殖比較 牙周膜成纖維附著TW后細(xì)胞增殖的幅度較單獨(dú)二維培養(yǎng)有所增加。見圖2。

圖2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組細(xì)胞培養(yǎng)2、4、6、8 d后的增殖水平

2.3PDLFs上清液AKP水平比較 在24 h，兩組細(xì)胞上清液AKP分泌水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而在48、72 h，TW組分泌量顯著多于礦化誘導(dǎo)組(P<0.05)。見表1。

表1 上清液AKP含量(金氏單位/100 ml)比較±s)

3 討 論

PDLFs是牙周組織再生的前體細(xì)胞，是PDL 的主要細(xì)胞成分，也是PDL 的主要功能細(xì)胞，PDLFs具有成纖維表型和成骨表型，其中，成骨表型包括成牙骨質(zhì)細(xì)胞表型和成骨細(xì)胞表型〔5〕，能分化為成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，具有形成牙骨質(zhì)、牙槽骨及牙周膜的能力〔6〕。Hasegawa等〔7〕將PDLFs制成細(xì)胞皮片，再復(fù)合細(xì)胞外基質(zhì)植入免疫缺陷小鼠皮下，發(fā)現(xiàn)有非細(xì)胞性牙骨質(zhì)形成，且有大量的密集排列的膠原纖維插入其中。此外，有學(xué)者利用具有多向分化能力的PDLFs均取得了向類牙骨質(zhì)和牙周膜纖維方向誘導(dǎo)分化的成功，使其成為牙周組織工程最重要的種子細(xì)胞〔8〕。

目前牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法主要有酶消化法和組織塊法，酶消化法操作方法復(fù)雜，獲得的細(xì)胞不純，組織塊法有細(xì)胞游出比較緩慢且數(shù)量少的缺點(diǎn)〔9〕。本實(shí)驗(yàn)通過電子顯微鏡觀察到細(xì)胞形態(tài)均為長梭形星形或多角形細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)上皮樣細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)染色波形蛋白呈陽性反應(yīng)，說明細(xì)胞來源于中胚層，角蛋白陰性排除上皮性來源細(xì)胞混雜，細(xì)胞來源可靠，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，含有豐富的高爾基體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，說明所培養(yǎng)的細(xì)胞合成蛋白質(zhì)功能活躍，礦化結(jié)節(jié)實(shí)驗(yàn)證明其有向硬組織分化的能力。

因?yàn)殁伈牧暇哂薪艹龅纳锵嗳菪院蜕锇踩浴?yōu)良的耐腐蝕性、適宜的力學(xué)性能和良好的加工性，廣泛應(yīng)用于口腔各種修復(fù)體的制作，尤其是骨結(jié)合理論的創(chuàng)立和發(fā)展，鈦種植體已經(jīng)成為牙種植體最重要、最廣泛的一種。眾多學(xué)者將鈦材料和PDLFs等種子細(xì)胞用于牙周組織工程研究。如Choi將狗PDLFs分離培養(yǎng)后附著到鈦種植體表面，再植入同源性狗的下頜骨內(nèi)，3個(gè)月后組織切片發(fā)現(xiàn)種植體表面有類牙骨質(zhì)形成，并有膠原纖維垂直插入其中〔10〕。

目前，臨床上大部分種植體通過酸蝕、噴砂等手段改變種植體表面形態(tài)，但仍然屬于二維結(jié)構(gòu)。TW材料可通過高溫真空焊接到鈦柱表面，形成三維結(jié)構(gòu)的種植體。將高密度細(xì)胞接種在具有一定空間結(jié)構(gòu)，有一定孔隙率，孔徑大小，孔間交通的支架材料上，細(xì)胞在模擬體內(nèi)細(xì)胞的化學(xué)、物理和生物學(xué)條件下，在三維基質(zhì)支架中進(jìn)行培養(yǎng)稱為三維培養(yǎng)〔11〕。通過將體外培養(yǎng)的PDLFs接種到TW上復(fù)合立體培養(yǎng)，使與牙周組織的主要功能細(xì)胞PDLCs直接接觸，檢測(cè)材料對(duì)細(xì)胞增殖分化的影響，為TW材料構(gòu)建牙周組織工程支架的可能性提供初步的研究數(shù)據(jù)，本次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證鈦網(wǎng)材料三維培養(yǎng)較二維培養(yǎng)具有明顯的促增殖作用。

PDLFs成骨表型和成牙骨質(zhì)表型都可以分泌AKP，而AKP的表達(dá)可作為牙骨質(zhì)形成過程中成骨細(xì)胞或成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化早期的標(biāo)志，礦化組織的形成則可作為其分化末期的指標(biāo)〔12〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TW材料對(duì)于PDLFs早期促礦化的能力要優(yōu)于傳統(tǒng)礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液。

綜上所述，TW材料能有效促進(jìn)犬PDLFs附著增殖、分化，為后期牙周組織工程再生相關(guān)種子細(xì)胞的選擇和支架材料的構(gòu)建提供理論和基礎(chǔ)，為口腔常見牙周病、牙列缺損缺失提供治療思路〔13〕。

4 參考文獻(xiàn)

1薛 敏，于江波，張 月，等.TGF-β1在應(yīng)力介導(dǎo)的牙周膜成纖維細(xì)胞增殖中的作用及其機(jī)制〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013；13(7)：1240-3，1344.

2Li D，Iku S，Nemoto K，etal.Geometry of artificial ECM：three-dimensional structure of titanium-web (TW) promotes differentiation of human bone marrow mesenchymal cells into osteoblasts〔J〕.J Hard Tissue Biology，2005；14(2)：333-4.

3Ichinohe N，Kuboki Y，Tabata Y.Bone regeneration using titanium nonwoven fabrics combined with FGF-2 release from gelatin hydrogel microspheres in rabbit skull defects〔J〕.Tissue Engineering Part A，2008；14(10)：1663-71.

4蔣俊強(qiáng)，王忠朝，黎春暉，等.三種方法原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010；14(23)：4290-4.

5Shi S，Huang GT，Gronthos S.Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs.those from other sources：Their biology and role in regenerative medieine〔J〕.J Dental Res，2009；88(9)：792-806.

6Flores MG，Yashiro R，Washio K.Periodontal ligament cell sheet promotes periodontal regeneration in athymic rats〔J〕.J Clin Periodontol，2008；35(12)：1066-72.

7Hasegawa M，Yamato M，Kikuchi A,etal.Human periodontal ligament cell sheets can regenerate periodontal ligament tissue in an athymic rat model〔J〕.Tissue Eng，2005；11(3-4)：469-78.

8Yang Z，Jin F，Zhang X.Tissue engineering of cementum/periodontal-ligament complex using a novel three-dimensional pellet cultivation system for human periodontal ligament stem cells〔J〕.Tissue Eng Part C Methods，2009；15(4)：571-81.

9李 雋，胥 春，郝 軼，等.人牙周膜細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定〔J〕.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2008；28(11)：1373-6.

10Choi BH.Periodontal ligament formation around titanium implants using cultured periodontal ligament cells：a pilot study〔J〕.Int J Oral Maxillofac Implants，2000；15(2)：193.

11Cao Y，Li D，Shang C,etal.Three-dimensional culture of human mesenchymal stem cells in a polyethylene terephthalate matrix〔J〕.Biomed Mate，2010;5(6):065013.

12Lin NH，GronthosS，Bartold PM.Stem cells and periodontal regeneration〔J〕.Australian Dental Journal，2008;53(2)：108-121.

13彭國富，張小玲.人工種植牙的義齒修復(fù)及臨床治療效果〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；33(9)：2174-5.