孫雅彬 王大廣 宋 鄂 葉 飛 張 泳 孫雅敏 徐越超

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院眼科，吉林 長春 130021)

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(DR)是正處在工作年齡的成年人失明的一個重要原因〔1,2〕。在視網(wǎng)膜中Müller細(xì)胞與葡萄糖的代謝關(guān)系極其密切，它可以優(yōu)先攝取葡萄糖，通過糖原代謝、有氧及無氧糖酵解為內(nèi)層其他細(xì)胞供能，并且Müller細(xì)胞的突起包繞在視網(wǎng)膜的神經(jīng)元及血管周圍，與視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞及視網(wǎng)膜血管發(fā)生多種功能的交互作用。在高糖等病理條件下，Müller細(xì)胞可以通過生理的和生物合成的變化，影響視網(wǎng)膜內(nèi)層細(xì)胞的代謝活動，干擾視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞和血管的正常功能〔3～6〕。本文通過檢測不同葡萄糖濃度培養(yǎng)的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞增殖情況，了解高糖對Müller細(xì)胞增殖的影響，并且通過PPA技術(shù)檢測高糖與正常血糖濃度下Müller細(xì)胞中蛋白質(zhì)的表達情況，分析差異表達的蛋白質(zhì)，明確高糖培養(yǎng)的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達特征。

1 材料與方法

1.1化學(xué)藥品 無血清DMEM加入葡萄糖(Fisher Scientific公司, 美國Fair Lawn))至終濃度為5，10， 25，50 mmol/L。

1.2大鼠視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 按照我們以往實驗的方法進行大鼠視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定〔7〕。

1.3細(xì)胞增殖 MTT法用以檢測高糖引起的Müller 增殖。第三代Müller 細(xì)胞接種于96孔板，每空細(xì)胞數(shù)約為5×103，無血清DMEM內(nèi)孵育24 h。更換為高糖條件液再次孵育72 h。 然后每孔加入5 mg/ml 的MTT 10 μl再次孵育3 h。去掉上清液，每孔加入100 μl DMSO，用ELx800(Bio-Tek Instruments公司，美國 Winooski)分光光度儀，波長570 nm測量每孔的光度值。

1.4Protein pathway array Müller 細(xì)胞(1×106) 于10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)無血清DMEM培養(yǎng)24 h。然后細(xì)胞更換培養(yǎng)液為50 mmol/L葡萄糖培養(yǎng)72 h。用1倍細(xì)胞裂解液(Cell Signaling Technology公司，美國Danvers),包含20 mmol/L Tris-HCl (pH7.5)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L Na2EDTA，1 mmol/L EGTA，1% Triton，2.5 mmol/L焦磷酸鈉，1 mmol/L β-甘油磷酸鈉，1 mmol/L Na3VO4和1 μg/ml亮抑蛋白酶肽，提取細(xì)胞總蛋白。 每個培養(yǎng)皿中加入300 μl裂解液，用細(xì)胞刮板刮除培養(yǎng)皿表面的單層細(xì)胞。細(xì)胞裂解產(chǎn)物超聲裂解15 s，2次，14 000 r/min，4℃，離心30 min。BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Pierce公司，美國Rockford)檢測蛋白質(zhì)濃度。按前文所描述〔8〕，進行PPA流程。

1.5信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)分析 應(yīng)用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)，一種基于互聯(lián)網(wǎng)的信號通路分析軟件，進行蛋白質(zhì)之間生物功能的關(guān)聯(lián)性分析。 將PPA中檢測到的表達有顯著差異(P<0.05)的蛋白質(zhì)輸入IPA軟件，進行經(jīng)典信號傳導(dǎo)通路的功能性分析。以IPA軟件內(nèi)已知文獻中各基因或蛋白質(zhì)的相互作用為基礎(chǔ)，將所輸入蛋白質(zhì)之間的直接或間接的作用進行分析，并最終構(gòu)建出新的信號通路。應(yīng)用數(shù)據(jù)庫內(nèi)的基因功能性分析，還能夠分析出所輸入蛋白質(zhì)與哪些已知疾病的最具有關(guān)聯(lián)性，并且應(yīng)用Fisher精確檢驗計算P值。蛋白質(zhì)在分析結(jié)果中被表示為“節(jié)點”，每兩個“節(jié)點”之間的關(guān)系由一條直線表示，每條直線至少有一篇參考文獻支持。

2 結(jié) 果

2.1高糖刺激Müller 細(xì)胞增殖 孵育72 h后，Müller細(xì)胞的增長呈葡萄糖濃度依賴性(50 mmol/L葡萄糖濃度增殖最強)。

2.2高糖條件下Müller細(xì)胞中的差異表達蛋白 根據(jù)配對t檢驗(P<0.05)和倍數(shù)變化值(>1.5)結(jié)果，在這些表達的蛋白質(zhì)中，有47種蛋白質(zhì)在正常葡萄糖濃度和高糖兩組間表達量有顯著性差異。其中40種蛋白質(zhì)在高糖條件下高表達，包括VEGF (10.58 倍)，XIAP (3.33 倍)，Cyclin E (9.02 倍)，Nkx-3.1(8.76 倍)，PDEF (6.03 倍)，TNF-α(5.70 倍)，NFκB p65(4.24 倍)，IL-1β (5.49 倍)，Cdk4(5.48 倍)，p-PKC-α/βⅡ(5.46 倍)，NFκB p50(5.21 倍)，Bax (5.01 倍)，p38 (4.96 倍)，cdk2 p34(4.14 倍)，p-PKC-α(4.02 倍)，Cyclin B1(3.95 倍)，Cdk6(3.73 倍)，Cdk2(3.64 倍)，p-PTEN(3.56 倍)，Cyclin D1(3.38 倍)，Cdc25B(3.29 倍)，PTEN(2.98 倍)，Cdc25C(2.90 倍)，HIF-1α(2.59 倍)，ERK(2.55 倍)，p-Stat3(2.41 倍)，HIF-3α(2.40 倍)，p27(2.35 倍)，Bcl-6(2.30 倍)，Bcl-xL(1.89 倍)，uPA(1.54 倍)和p-AKT(1.53 倍)；其中7種蛋白質(zhì)在高糖條件下表達下調(diào)，包括 p-GSK-3a/β(-9.24 倍)，p-p53(-7.35)，Erα(-4.56 倍)，KAI1(-3.53 倍)和RIP(-2.36 倍)?；贗PA結(jié)果，這47種蛋白質(zhì)參與了幾條重要的信號傳導(dǎo)通路，包括XIAP/Apoptosis信號通路(p-p53, NFκB p65, p38, Bax, NFκB p50, c-IAP2, TNF-α, Bak, XIAP)，PI3K/AKT 信號通路(p-p53, NFκB p65, p-Akt, p38, 14-3-3 β, Hsp90, p-GSK-3α/β, NFκB p50, Cyclin D1, PTEN)，ILK信號通路(VEGF, NFκB p65, p-Akt, p38, p-GSK-3α/β, HIF-1α, NFκB p50, Cyclin D1, TNF-α, PTEN)，PTEN信號通路(NFκB p65, p-Akt, p-p38, p-GSK-3α/β, NFκB p50, Cyclin D1, Bcl-xL, PTEN)，細(xì)胞周期：G1/S 節(jié)點調(diào)控信號通路(p-p53, p-RB, Cyclin E, Cdk4, Cdk6, Cyclin D1, Cdc2 p34)，HIF-1α信號通路(VEGF, Epo, p-p53, p-Akt, p38, Hsp90, HIF-1α)，細(xì)胞周期：G2/M 節(jié)點調(diào)控信號通路(Cdc25B, p-p53, Cdc25C and Cyclin B1, 14-3-3 β)，HGF信號通路(p-Akt, p-p38, p-Stat3, Cyclin D1, Cdc2 p34)，糖尿病信號通路(NFκB p65, p-Akt, p38, NFκB p50, TNF-α)，NFκB 信號通路(NFκB p65, p-Akt, RIP, IL-1β, NFκB p50, TNF-α)，VEGF 信號通路(VEGF, p-Akt, p38, HIF-1α)，ERK/MAPK信號通路(p38, p-GSK-3α/β, p-Stat3)和胰島素受體信號通路(p-Akt, p38, p-GSK-3α/β, PTEN)。這些結(jié)果提示高糖可以引起 Müller 細(xì)胞中信號傳導(dǎo)通路改變，這些改變共同促使Müller細(xì)胞存活和增殖。

2.3IPA軟件構(gòu)建出高糖培養(yǎng)的視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞差異表達蛋白質(zhì)關(guān)系圖 將PPA結(jié)果所篩選的47種差異表達蛋白質(zhì)輸入IPA信號通路軟件進行分析，構(gòu)建出這些蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系圖(圖1)。

圖1 高糖誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞中差異表達蛋白的信號網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

3 討 論

在糖尿病患者眼內(nèi)Müller細(xì)胞表現(xiàn)為膠質(zhì)細(xì)胞增生，細(xì)胞數(shù)量增多〔9〕。神經(jīng)膠質(zhì)增生出現(xiàn)在血腦屏障破壞之后，這樣就進一步加重了血管功能障礙。神經(jīng)膠質(zhì)增生可能是由氧化應(yīng)激以及多元醇通道的激活引起，因為這些通道的藥理激活抑制了膠質(zhì)纖維酸性蛋白的上調(diào)。糖尿病患者以及動物模型的Müller細(xì)胞的數(shù)量都增加了并且Müller細(xì)胞也被激活了，這體現(xiàn)在膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAF)以及巢蛋白的表達上調(diào)〔10〕。

Müller細(xì)胞會釋放血管生成因子以及神經(jīng)元營養(yǎng)因子以保護視網(wǎng)膜免受高血糖癥誘導(dǎo)應(yīng)力并最終對DR的發(fā)病機制做出貢獻。VEGF是從DR早期的Müller細(xì)胞中釋放出來的〔11〕，并且通過局部增加血管的滲透性來提高灌注，同時抗血管生成的PEDF也減少了〔12〕。VEGF以及其他的分泌因子，如堿性成纖維細(xì)胞生長因子，也是神經(jīng)營養(yǎng)的，而且它們可能會保護神經(jīng)元免受高血糖誘發(fā)的氧化應(yīng)激〔13〕。目前尚不清楚血管生成因子的作用是否支持糖尿病視網(wǎng)膜中的應(yīng)力神經(jīng)元或是增加閉塞血管的滲透性。慢性暴露于這些因子會導(dǎo)致一個兩相的視網(wǎng)膜反應(yīng)，而且增加的滲透性會促進應(yīng)力因子的進一步滲透并最終釋放更多的滲透因子從而形成一個有害的正回饋循環(huán)。這樣就行成了糖尿病黃斑水腫，而且它是患有DR患者失明的一個主要原因〔14〕。在糖尿病患者以及動物模型的玻璃體以及視網(wǎng)膜中已經(jīng)檢測到VEGF〔15,16〕。此外，VEGF以及PEDF的眼內(nèi)層能夠?qū)Ψ窃鲋称贒R向增殖期DR的轉(zhuǎn)變做出預(yù)測〔14〕。同樣地，對VEGF的抑制會阻止患有糖尿病動物的血視網(wǎng)膜屏障的衰退而且在臨床上已經(jīng)開始血管內(nèi)皮生長因子抗體的作用來治療糖尿病黃斑水腫以及增殖期DR〔17,18〕。

膠質(zhì)激活可能會導(dǎo)致與DR進程相關(guān)的炎癥。Müller細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或者是滲透到視網(wǎng)膜的白細(xì)胞都可以分泌細(xì)胞因子〔19〕?；钚匝跻约巴砥谔腔K末產(chǎn)物的受體都已經(jīng)在Müller細(xì)胞上得到表達，而且它們對于DR的發(fā)病機制都是非常重要的，因為氨基胍治療會抑制DR在動物模型的發(fā)展〔20〕。誘生型氮氧合酶的數(shù)量在糖尿病人類患者以及動物模型都增加了而且它和VEGF超表達一樣都位于Müller細(xì)胞，而且它還可能與糖尿病中血視網(wǎng)膜屏障破壞有關(guān)〔21〕。

我們的實驗結(jié)果清晰的顯示，高糖可以刺激Müller細(xì)胞增殖，這種增殖作用是Müller細(xì)胞中幾條重要的信號傳導(dǎo)通路共同參與的結(jié)果，并且 PPA結(jié)果 和IPA 軟件分析證實高糖影響了細(xì)胞內(nèi)許多經(jīng)典信號傳導(dǎo)通路，包括 XIAP/凋亡信號通路，VEGF 信號通路和細(xì)胞循環(huán)調(diào)控通路等。這些信號傳導(dǎo)通路的變化可以減少Müller 凋亡，促進細(xì)胞存活，為DR的發(fā)病機制研究提供新的依據(jù)。

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