宣 毅 黃正團(tuán) 周仲昭 宣偉軍

(School of Engineering，Tufts University，Medford，Massachusetts 02155，USA)

細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是衰老的重要因素之一〔1〕,也是耳蝸損害的重要機(jī)制之一〔2〕。銅(Cu)、鋅(Zn)、超氧化物歧化酶(SOD)是耳蝸?zhàn)钪匾淖杂苫x酶，構(gòu)成耳蝸抗氧化關(guān)鍵防御系統(tǒng)〔3〕。復(fù)方健耳劑具有對(duì)抗小鼠老年性耳蝸毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元凋亡及疆孔神經(jīng)纖維退變的作用〔4，5〕，本研究應(yīng)用Real-Time PCR技術(shù)，以幼齡即開始出現(xiàn)聽(tīng)力衰退的DBA/2J小鼠作為試驗(yàn)對(duì)象〔6，7〕，觀察復(fù)方健耳劑對(duì)小鼠耳蝸組織SOD1基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 美國(guó)GeneCopoeia 公司提供： mRNA合成單鏈擴(kuò)增的反轉(zhuǎn)錄試劑盒First Strand cDNA Synthesis Kit(Cat.No.C0210A )；PCR(染料法)試劑All-in-OneTMQ-PCR Mix(Cat.No.D0101A)；熒光定量PCR引物All-in-OneTMQ-PCR Primer(Cat.No.HQP006940) 。由美國(guó)Invitrogen公司提供總RNA抽提試劑TRIzol (Cat.No 15596-018)。美國(guó)Bio-Rad實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)：MyiQ5 Real Time PCR Detection System。日本TaKaRa常規(guī)PCR儀：PCR Thermal Cycler。美國(guó)Thermo Fisher Scientific紫外分光光度計(jì)：NanoDrop ND-1000。

1.2動(dòng)物及分組 選擇斷奶1月齡、SPF級(jí)、健康DBA/2 J小鼠共10只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005。動(dòng)物的雌雄不拘，隨機(jī)平均分為對(duì)照組和中藥組各5只。對(duì)照組小鼠食用小鼠常規(guī)飼料和飲用自來(lái)水。中藥組小鼠食用相同的小鼠常規(guī)飼料，但飲用中藥水煮溶液以代替日常飲水，各組均待小鼠成長(zhǎng)至5月齡時(shí)終止實(shí)驗(yàn)，然后斷頭取兩側(cè)耳蝸置液氮中冰凍備用。

1.3實(shí)驗(yàn)藥物及喂藥 本次實(shí)驗(yàn)所用中藥復(fù)方健耳劑選自原健耳Ⅱ號(hào)中成藥膠囊配方，由黃芪、女貞子、丹參、郁金、絞股藍(lán)等藥組成，但改為原始湯劑口服液，即水煮3次，過(guò)濾，濃縮至1∶1.22，相當(dāng)于1.22 ml含1 g生藥材量。按照《中藥藥理研究方法學(xué)》〔8〕小鼠與成人用量換算法計(jì)算出小鼠用量應(yīng)為，復(fù)方健耳劑0.7 ml·kg-1·d-1，并加上適量水配兌(一般為1 ml藥液加20 ml水),盛在動(dòng)物自吸喂養(yǎng)瓶?jī)?nèi)供小鼠飲用。在無(wú)其他水源供應(yīng)的條件下，動(dòng)物基本因口渴可飲下每日內(nèi)服中藥劑量。

1.4檢測(cè)方法 選擇PCR內(nèi)參引物序列GAPDH：正義鏈(5′-3′)：CTTGGGCTACACTGAGGACC，反義鏈(5′-3′):CATACCAGGAAATGAGCTTGAC。PCR目標(biāo)引物序列SOD1：正義鏈(5′-3′)GGGTTCCACGTCCATCAGTA，反義鏈(5′-3′)：AGTCACATTGCCCAGGTCTC。每組5對(duì)耳蝸標(biāo)本在液氮中充分研磨成粉末狀，加入到TRizol液中，震蕩混勻，加入氯仿，振蕩混勻，離心，相分離，取最上層，獲得RNA樣品，置入冷凍異丙醇的新離心管(DEPC處理管)中混勻，離心，RNA沉淀，冷凍75%乙醇，離心，RNA洗滌，去上清液，風(fēng)干揮發(fā)乙醇，加入DEPC水，在Nanodrop上測(cè)定RNA濃度和OD 260/280比值，確認(rèn)RNA沒(méi)有蛋白等污染。RNA-Primer Mix 配制反應(yīng)，離心，65℃RNA變性，在RNA-Primer Mix反應(yīng)管內(nèi)加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，離心后37℃孵育，85℃滅活處理，滅菌水稀釋，-20℃保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物待用。制備PCR反應(yīng)混合液，加入96孔板中，離心，確保所有反應(yīng)液在反應(yīng)孔底部。在MyiQ5 Real Time PCR Detection System中經(jīng)溫度梯度分別進(jìn)行預(yù)變性、變性、退火、延伸等反應(yīng)處理，測(cè)出內(nèi)參基因GAPDH和目的基因SOD1在不同樣本中擴(kuò)增的Ct值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

對(duì)照組耳蝸組織SOD1表達(dá)量為1.624±0.425較中藥組(5.114±2.432)明顯降低(t=-3.817，P<0.019)。

3 討 論

氧自由基升高或耗竭內(nèi)源性抗氧化劑可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔9～11〕。氧自由基誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制目前尚未完全闡明，一般認(rèn)為，活性氧自由基(ROS) 可以通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷DNA，影響信號(hào)傳導(dǎo)以及參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。原癌基因Bcl-2是線粒體死亡途經(jīng)中調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因， Bcl-2抗凋亡的機(jī)制是通過(guò)抗氧化途徑。在各種癌組織中，Bcl-2表現(xiàn)為過(guò)度表達(dá)，其抗細(xì)胞凋亡的功能大小與其表達(dá)水平密切相關(guān)。ROS是重要的細(xì)胞內(nèi)分子傳導(dǎo)信號(hào)，能夠調(diào)控Bcl-2表達(dá)，從而影響B(tài)cl-2的功能。研究已證實(shí)超氧化物陰離子(O2-)能夠下調(diào)或降低Bcl-2表達(dá)，進(jìn)而誘使蛋白酶體介導(dǎo)泛素依賴性的蛋白酶解反應(yīng)，降解細(xì)胞質(zhì)中的目標(biāo)蛋白以及核內(nèi)蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔12〕。也有研究認(rèn)為〔13〕，氧自由基能夠引起DNA損傷，導(dǎo)致DNA 模板的構(gòu)象變化，即 mtRNA 氧化損傷后可造成堿基片段丟失，堿基修飾及插入突變，導(dǎo)致多聚ADP 核糖聚合酶(PARP)活化，使糖氧化分解、電子傳遞和ATP 形成減慢，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP池枯竭，DNA修復(fù)無(wú)效并發(fā)生片段化，成為細(xì)胞凋亡的觸發(fā)因子，引起細(xì)胞凋亡。

研究表明老年性聾與耳蝸感音神經(jīng)細(xì)胞線粒體ROS積累并攻擊損害細(xì)胞密切相關(guān)〔20〕?，F(xiàn)代中藥藥理研究表明中藥復(fù)方健耳劑所選藥物具有廣泛藥理作用，符合針對(duì)老年性聾的現(xiàn)代多種病因?qū)W說(shuō)。其中改善血循環(huán)，調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝，清除自由基可能是其有效保護(hù)耳蝸老年性退變的主要藥理效應(yīng)。自由基影響學(xué)說(shuō)是機(jī)體衰老的重要機(jī)制之一。一方面氧自由基產(chǎn)生和積累過(guò)多，作用于生物膜上的多不飽和脂肪酸，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，從而破壞生物膜的完整性，引起毛細(xì)胞等代謝障礙〔21〕，或細(xì)胞內(nèi)線粒體DNA損傷，導(dǎo)致基因突變，引起老年性聾〔22〕。復(fù)方健耳劑中已知所選藥物如黃芪、女貞子、丹參、郁金、絞股藍(lán)等能明顯提高機(jī)體超氧化物歧化酶和谷胱苷肽酶含量和活性，和細(xì)胞膜Na+,K+-ATP酶活性，促進(jìn)抗氧化，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基能力，阻止細(xì)胞膜和線粒體膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜和線粒體膜的作用〔23，24〕。本研究結(jié)果提示復(fù)方健耳劑能夠促進(jìn)抗氧化，增強(qiáng)細(xì)胞清除自由基能力，從而有效保護(hù)細(xì)胞膜和線粒體膜，起到對(duì)抗和延緩老年性聾的作用。因此，復(fù)方健耳劑對(duì)SOD1的表達(dá)影響可能是其有效對(duì)抗老年性耳蝸感音神經(jīng)性損害的重要機(jī)制之一。

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