劉豐熙 牛 凱 李 煒 薛貴平 王 樹 張丹參

(河北北方學院藥學系，河北 張家口 075000)

血管性癡呆(VD)占全部老年癡呆的35.8%～39%，是僅次于阿爾茨海默病(AD)的第二大癡呆病因。VD屬于中醫(yī)的 “癡呆”、“呆癥”、“健忘”等的范疇〔1〕，病位在腦，與心和腎的關系密切。目前對于中藥復方治療VD的實驗研究報道不多，對比其治療效果的研究更少。李東騰等〔2〕曾做過天王補心丹改善記憶的研究，馮炯等〔3〕曾做過六味地黃丸改善SAMP8小鼠的學習記憶的研究。本實驗從補心、補腎治療角度入手，選擇補益心血的代表方天王補心湯、補益腎精的代表方六味地黃湯作為研究對象，通過對VD治療效果的互相比較研究，找出治療VD的較佳方藥。

1 材料與方法

1.1動物 健康昆明種小鼠，體重(28±2)g，均為雄性，由中國醫(yī)學科學院藥物研究所動物實驗中心提供。全部動物在實驗室適應性飼養(yǎng)3 d后用于實驗，分籠飼養(yǎng)，自由飲食和飲水。室溫(20±2)℃。

1.2主要藥品、試劑 天王補心湯：酸棗仁、柏子仁、當歸、天冬、麥冬、生地、人參、丹參、玄參、白茯苓、遠志、桔梗；六味地黃湯：熟地、山萸肉、山藥、澤瀉、丹皮、茯苓；均購自張家口市華佗藥房，藥液先按照臨床用藥煎煮方法熬制成常規(guī)藥液。腦復康：購自石家莊市華新制藥廠，批號N091203。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒：南京建成生物工程研究所。3.5%水合氯醛、液體石蠟、生理鹽水(NS)、肝素、0.025 mmol/L氯化鈣、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液。

1.3儀器 SBA-2程控避暗箱：中國醫(yī)學科學院藥物研究所。XTY-2探索運動試驗儀：中國醫(yī)學科學院藥物研究所。STT-2跳臺儀：中國醫(yī)學科學院藥物研究所。LabTech紫外可見分光光度計UA-2100：北京萊博泰科儀器有限公司。Sigma-3k30：高速冷凍離心機：美國Sigma公司。BT224S電子天平：德國Sartorius公司。1512型石蠟切片機：西德萊卡公司。TS-12E自動脫水機：湖北孝感電子儀器廠。LKB NovaIV超薄切片機：瑞典LKB公司。顯微鏡：YM200，日本OLYMPUS。

1.4方法

1.4.1實驗分組 隨機分為正常組、假手術組、模型組、腦復康組、六味地黃湯組、天王補心湯組，每組15只。

1.4.2模型制備與給藥方法 在Himori法〔4〕基礎上進行改進。3.5%水合氯醛(10 ml/kg，腹腔注射)麻醉小鼠后，仰臥位固定，自胸骨柄到下頜骨間行5～8 mm正中縱向切口，分離兩側頸總動脈，分離后用液體石蠟浸泡過的黑色手術線穿過左右二側頸總動脈，盡量恢復兩側頸總動脈到原位，在氣管上方輕輕將黑色手術線打一松的反手結，結的松緊以不壓迫氣管為宜。在每側頸總動脈上方的黑線上穿過一條用液體石蠟浸泡過的白色手術線，按Himori法埋線后縫合切口。術后48 h將頸下部黑色手術線拉緊，阻斷兩側頸總動脈造成大腦缺血狀態(tài)， 5 min后輕拉兩側白色手術線，使頸總動脈恢復血液再灌注。術后各組動物均灌胃給藥，給藥標準為20 ml/kg，六味地黃湯組、天王補心湯組、腦復康組小鼠每日早7:00給藥，1次/d；正常組、假手術組、模型組每日早7:00給予等量蒸餾水，1次/d；共給藥14 d。

1.5行為學實驗〔5〕

1.5.1避暗實驗 給藥后1 h進行避暗實驗，實驗分為訓練和測試，訓練前將小鼠放入避暗箱內適應3 min，然后將小鼠背向洞口放入明室，同時啟動自動記錄裝置，由于小鼠具有嗜暗習性，易進入暗室，進入暗室后由于受到電擊迅速逃離暗室。在5 min內經(jīng)多次電擊，小鼠形成記憶，記錄24 h后測驗時3 min內小鼠受到電擊的次數(shù)(錯誤次數(shù))以及首次犯錯誤的時間(逃避潛伏期)。

1.5.2跳臺實驗 給藥后1 h進行跳臺實驗，先將小鼠放入反應箱內適應 3 min，然后立即通以36 V的交流電，動物受到電擊，其逃避反應即為跳上平臺，部分動物會再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺，如此訓練 3 min。24 h后，在底部銅柵通電的情況下，直接將小鼠輕輕置于平臺上，記錄從小鼠被放至平臺到第一次跳下的時間，即潛伏期；同時記錄 3 min內小鼠跳下平臺的次數(shù)，即錯誤次數(shù)。

1.5.3探索實驗 給藥后1 h進行探索實驗，首先將小鼠放在前面的明室中，點擊實驗開始，同時打開箱門，當小鼠鉆進暗室時，則關上門斷其后路。記錄小鼠到達暗室時間、到達高端時間、到達明室時間;小鼠在暗室滯留時間、小鼠在明室滯留時間、小鼠爬高端的次數(shù)。

1.6小鼠腦組織生化指標的測定

1.6.1腦組織勻漿的制備 按照文獻方法〔6，7〕，行為學實驗結束后，將小鼠迅速斷頭處死，在生理鹽水冰塊上迅速打開顱骨取腦，將腦膜和小腦剝離，保留大腦，用冷生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干表面的水分，稱重，放入干燥的玻璃器皿中，加入9倍重量的4℃生理鹽水，用內切式組織勻漿機勻漿，轉速10 000～15 000 r/min，每次勻漿10 s，間隔30 s，連續(xù)3～5次，即可制成10%腦勻漿，以3 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.6.2小鼠腦組織內SOD，丙二醛(MDA)含量測定 取按照1.6.1方法制備好的腦勻漿上清液適量，按照SOD，MDA試劑盒說明書測定，計算小鼠腦組織SOD，MDA含量。

1.7病理實驗 神經(jīng)行為測試結束后，頸椎脫臼猝死，剝離顱骨至枕骨大孔以上，快速摘取全腦組織于冰皿上，迅速分離雙側大腦半球，取小鼠左側大腦組織用10%甲醛固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟浸透、包埋后連續(xù)切片(厚度5 μm)，貼附于APES預處理過的載玻片上，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察腦組織病理變化。

2 結 果

2.1六味地黃湯、天王補心湯對VD小鼠的神經(jīng)行為學影響 在避暗試驗中，與假手術組相比，模型組小鼠進入暗室潛伏期顯著縮短(P<0.05)、錯誤次數(shù)顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，各治療組進入暗室的潛伏期顯著延長(P<0.05)、錯誤次數(shù)顯著減少(P<0.05)。與腦復康組相比，六味地黃湯組和天王補心湯組小鼠進入暗室的錯誤次數(shù)顯著減少(P<0.05)。見表1。在跳臺實驗中，與假手術組相比，模型組小鼠從平臺跳下的潛伏期顯著縮短(P<0.05)，犯錯誤次數(shù)顯著增多(P<0.01)。與模型組相比，各治療組小鼠從平臺跳下的潛伏期顯著延長(P<0.05，P<0.01)，犯錯誤次數(shù)顯著減少(P<0.05，P<0.01)。與腦復康組相比，六味地黃湯組和天王補心湯組小鼠從平臺跳下的潛伏期顯著延長(P<0.05，P<0.01)；小鼠犯錯誤次數(shù)顯著減少(P<0.05，P<0.01)。見表2。在探索實驗中，與假手術組相比，模型組小鼠到達暗室、高端以及明室時間均明顯延長(P<0.05)，爬高端的次數(shù)明顯減少(P<0.05)，在暗和明室的滯留時間有明顯差異(P<0.001)。與模型組相比，各治療組小鼠到達暗室、高端以及明室的時間均明顯縮短(P<0.05)，小鼠爬高端的次數(shù)明顯增加(P<0.05)，在暗室和在明室的滯留時間無明顯差異(P﹥0.05)。與腦復康組相比，六味地黃湯組和天王補心湯組小鼠到達暗室、高端和明室的時間明顯縮短(P<0.05，P<0.01)；小鼠爬高端的次數(shù)明顯增加(P<0.05)。見表3。腦復康、六味地黃湯和天王補心湯對小鼠被動回避學習記憶有改善作用，六味地黃湯和天王補心湯對小鼠被動回避學習記憶的改善作用綜合優(yōu)于腦復康，天王補心湯對小鼠被動回避學習記憶的改善作用最明顯。

表1 六味地黃湯、天王補心湯對腦缺血再灌注小鼠避暗實驗的影響±s，n=15)

2.2六味地黃湯、天王補心湯對模型小鼠腦組織內SOD、MDA的影響 與假手術組相比，模型組小鼠腦中SOD的含量均顯著降低(P<0.01)，MDA含量顯著增高(P<0.01)。與模型組相比，各治療組小鼠腦中SOD的含量均顯著增高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。與腦復康組相比，六味地黃湯組和天王補心湯組小鼠腦中SOD的含量均顯著增高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)；其中，天王補心湯組小鼠腦中SOD的含量增高最明顯，MDA含量降低最明顯。

表2 六味地黃湯、天王補心湯對腦缺血再灌注小鼠跳臺實驗的影響±s，n=15)

2.3六味地黃湯和天王補心湯對模型組小鼠腦組織海馬神經(jīng)元形態(tài)影響 正常組和假手術組神經(jīng)細胞排列緊密，層次分明，細胞結構清楚，細胞核及胞質清晰，尼氏體形態(tài)正常。模型組腦組織出現(xiàn)以神經(jīng)細胞損傷、膠質細胞增生、血管壁增厚為特征的病變。海馬區(qū)錐體神經(jīng)細胞數(shù)目減少，排列層次減少，伴有片狀軟化灶；大部分細胞核固縮深染，尼氏體減少或消失，胞體腫脹，出現(xiàn)了大量的空泡區(qū)；海馬內側局部膠質細胞增多，部分區(qū)域血管壁增厚。腦復康組大部分海馬錐體細胞恢復，排列較規(guī)整，部分細胞核固縮，散見有膠質細胞。尼氏體部分恢復正常，僅有小部分溶解。六味地黃湯組海馬錐體細胞形態(tài)完好，排列整齊，但仍有少數(shù)細胞核固縮為三角形或多角形。尼氏體形態(tài)大致正常。天王補心湯組海馬錐體細胞僅有少量脫失，細胞核仁清晰可見，胞質正常，仍可見少量膠質細胞。尼氏體大部分形態(tài)正常。

表3 六味地黃湯、天王補心湯對腦缺血再灌注小鼠在探索實驗中認知探索功能的影響±s，n=15)

表4 六味地黃湯、天王補心湯對腦缺血再灌注小鼠腦中SOD、MDA含量的影響±s，n=15)

3 討 論

六味地黃湯由宋朝的錢乙所創(chuàng)立，是滋補腎陰的經(jīng)典方、代表方，由熟地24 g、山萸肉12 g、干山藥12 g、澤瀉9 g、牡丹皮9 g、茯苓9 g組成，原方用丸劑，本實驗中為減小藥物劑型之間的差異性，統(tǒng)一改為湯劑使用，其功效為滋陰補腎，用治腎祛諸證。方中熟地、山萸肉、山藥三藥相配伍，功能滋養(yǎng)肝脾腎，以補腎陰為主。天王補心丹出自于《攝生秘剖》，由酸棗仁、柏子仁等13味中藥組成。全方共同起到滋陰養(yǎng)血、補心安神的作用，用于治療心陰虛血少、神志不安證。

通過服用六味地黃湯，腎陰得到補充，陰精化生有源，腦髓得以充養(yǎng)，通過服用天王補心湯，心陰心血得到補充，神有所養(yǎng)，人的正常心理、意識和思維活動得以正常進行，二者均使得VD小鼠的認知障礙得以緩解，學習記憶能力得到提高。

SOD是人體主要的抗氧化酶之一，它能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應，阻斷自由基的毒性反應〔8〕，清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷。MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質過氧化反應的代謝產(chǎn)物，間接反映了機體自由基產(chǎn)生的量和體內脂質過氧化反應的程度，MDA的量常作為反映機體內脂質過氧化的程度的指標〔9〕。通過對SOD、MDA含量的測定，發(fā)現(xiàn)六味地黃湯和天王補心湯能夠明顯提高SOD活性，降低MDA的含量，對腦細胞起到保護作用，可見六味地黃湯和天王補心湯具有較強的抗氧化能力，其作用機制可能是影響自由基的生成或清除，從而起到腦保護作用。通過光鏡觀察六味地黃湯和天王補心湯對VD小鼠的病理形態(tài)學影響，發(fā)現(xiàn)大部分神經(jīng)細胞形態(tài)恢復較好，排列較為整齊，尼氏體形態(tài)大致正常，說明六味地黃湯和天王補心湯對VD小鼠的腦神經(jīng)元有顯著保護作用，其中天王補心湯對VD小鼠的治療作用優(yōu)于六味地黃湯。

4 參考文獻

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