李 真

(河南理工大學(xué)體育學(xué)院人體科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南 焦作 454000)

基礎(chǔ)研究證實(shí)，哺乳動(dòng)物的脊髓神經(jīng)損傷后，通過內(nèi)源性修復(fù)產(chǎn)生的新生神經(jīng)細(xì)胞極少，也難以啟動(dòng)功能性軸突再生〔1〕，所以后期康復(fù)較難。近年來通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)移植以及神經(jīng)組織工程的發(fā)展為脊髓損傷的治療開辟了一條新途徑。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是一種存在于骨髓等多種組織中的具有多向分化能力的干細(xì)胞，具有很強(qiáng)的可塑性及趨化性，可以移行進(jìn)入組織，在適宜條件下可分化成為多種中胚層來源的組織細(xì)胞〔2〕，以誘導(dǎo)細(xì)胞的再生和生長(zhǎng)，對(duì)受損組織進(jìn)行修復(fù)。在BMSCs移植干預(yù)治療脊神經(jīng)損傷反面，張殿君等〔3〕研究指出，把有特定分化潛能的神經(jīng)前體細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷以及各種神經(jīng)退行性疾病，可以促進(jìn)患者神經(jīng)功能恢復(fù)。本研究觀察BMSCs移植治療脊髓神經(jīng)急性損傷大鼠的療效。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 Wistar健康大鼠(購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心)，清潔級(jí)，雄性，體重(160±14)g，8～10周齡，兩組大鼠模型由專人統(tǒng)一分籠飼養(yǎng)和料理(動(dòng)物房合格證號(hào)：豫醫(yī)動(dòng)字第4104022號(hào))，室內(nèi)通風(fēng)良好，室溫控制在24℃左右，每日兩次對(duì)大鼠進(jìn)行清理和消毒，避免傷口感染，每8 h對(duì)大鼠喂食一次，食量以大鼠自由進(jìn)食為主配以針管經(jīng)口腔注喂流體食物為輔，大鼠于護(hù)理期間無死亡；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；CO2孵箱(日本SANYO)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青)；SP試劑盒(北京中杉金橋)；神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)抗體(Santa Cruz公司)等。

1.2MSCs分離、培養(yǎng)和標(biāo)記 取Wistar健康大鼠1只，雄性，體重168.9 g，9周齡。無菌條件下分離大鼠雙側(cè)股骨，采集骨髓，貼壁法分離BMSCs，接種于25 cm2塑料瓶，加L-DMEM及體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后換液，去除未貼壁細(xì)胞，以后每3～5天換液1次，待細(xì)胞80%融合時(shí)用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，如此反復(fù)換液、消化，至第7代細(xì)胞。取第7代細(xì)胞，于培養(yǎng)液中加入Brdu進(jìn)行標(biāo)記，使其終濃度為15 μg/ml。將標(biāo)記好的BMSCs用胰酶消化(37℃，5 min)，使細(xì)胞游離后，加入含血清的新鮮培養(yǎng)基中止胰酶作用，彎頭吸管輕輕吹打細(xì)胞，將吹打下來的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管離心(1 500 r/min)，5 min，然后倒去上清，加入不完全培養(yǎng)基0.5～1 ml，重新懸浮細(xì)胞，并取30 μl進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)約為5×104/μl。

1.3脊髓損傷模型的建立 取Wistar大鼠50只備用，清潔級(jí)，雄性，標(biāo)記每只大鼠體重周齡。用特制椎板鉗咬除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物T8及T9棘突及椎板，顯露硬膜。使用動(dòng)脈瘤夾子，直接鉗夾T9段脊髓約0.5 s(操作方法：用改良的動(dòng)脈瘤夾子盡量咬除T9段棘突及椎板，標(biāo)定力量為35 g，用持夾器將動(dòng)脈瘤夾打開，然后突然釋放動(dòng)脈瘤夾，使脊髓受到突然的暴力打擊，打擊用時(shí)約0.5 s，操作過程中確保動(dòng)脈瘤夾的位置準(zhǔn)確。相關(guān)研究指出〔4〕：該法能保持硬脊膜的完整性，且脊髓損傷后的解剖結(jié)構(gòu)與神經(jīng)功能的變化與挫傷型脊髓損傷非常相似，且力量從2 ～98 g過程中發(fā)現(xiàn)鉗夾力越大，損傷區(qū)域殘存的軸突越少，功能恢復(fù)越不理想。本研究標(biāo)定力量為35 g，以快速擠壓造成脊髓急性完全損傷，建立脊神經(jīng)急性損傷模型。以鼠尾痙攣性擺動(dòng)、雙下肢癱為損傷標(biāo)準(zhǔn)。選取造模成功進(jìn)入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只，隨機(jī)分成對(duì)照組和BMSCs移植組各20只，兩組大鼠體重、周齡、下肢癱瘓程度等基本指標(biāo)無顯著性差異(P>0.05)。

1.4BMSCs移植 BMSCs移植組：脊髓損傷第7天和第28天，行第2次和第3次手術(shù)。暴露損傷脊髓，以微量注射器將含BMSCs(約為5×104/μl)的培養(yǎng)液5 μl緩慢注入脊髓損傷中心，3 min內(nèi)推完，留針5 min，并用醫(yī)用生物膠封閉針孔以防止細(xì)胞懸液外溢，逐層縫合傷口。對(duì)照組以模型組方法，注入等量生理鹽水。

1.5后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估 采用BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分系統(tǒng)〔5〕將大鼠后肢運(yùn)動(dòng)分為22個(gè)等級(jí)，后肢全癱為0分，完全正常為21分。分別在第2次手術(shù)后第1、2、3、4、6、8周，由同一實(shí)驗(yàn)人員連續(xù)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行單盲法評(píng)分。

1.6NGF和BDNF檢測(cè) 8 w后，處死兩組大鼠，開胸，經(jīng)心灌注200 ml 4℃的生理鹽水沖去血管中的血液，然后灌注4%的4℃的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH7.2～7.4)500 ml。灌注固定30 min后，取損傷區(qū)T8及T9段脊髓放入4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液24 h以上，于切片前先天晚上在最接近橫斷處切下1 cm放入20%蔗糖溶液中4℃過夜，石蠟包埋，用恒冷切片機(jī)連續(xù)切片，片厚25 μm。疫組織化學(xué)染色嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。每只大鼠隨機(jī)取5張切片，運(yùn)用圖像分析卡(北京天地公司)，IBM586和Olympus Bx60顯微鏡組成的圖像處理系統(tǒng)觀測(cè)，計(jì)算陽性反應(yīng)胞體的數(shù)量和各組NGF、BDNF陽性細(xì)胞的平均值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1BBB評(píng)分結(jié)果 傷前各組BBB評(píng)分均為21分。傷后各組大鼠均表現(xiàn)為完全截癱為0分。5 d后，對(duì)后腿針刺開始有回縮反應(yīng)，但差異不顯著(P>0.05)。于損傷第7天開始對(duì)兩組進(jìn)行移植后比較治療，第2周后出現(xiàn)后肢運(yùn)動(dòng)，3 w后可見明顯后肢活動(dòng)，6 w后后肢活動(dòng)趨于協(xié)調(diào)。傷后3～8 w后兩組評(píng)分差異顯著(P<0.05)，見表1。

表1 傷后兩組大鼠后肢活動(dòng)功能BBB評(píng)分(分，n=20,±s)

2.2NGF和BDNF蛋白檢測(cè)結(jié)果 移植組NGF和BDNF蛋白表達(dá)量(97.14±7.52，265.82±6.15)明顯高于對(duì)照組(35.26±4.71，112.34±5.74，P<0.05)。

3 討 論

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為：中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損后造成大量神經(jīng)元缺失時(shí)，因不能產(chǎn)生新的神經(jīng)元，建立新的突觸聯(lián)系，而致?lián)p傷后的功能難于恢復(fù)〔6〕。

干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)改變了以往認(rèn)為成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)神經(jīng)元不能再生的認(rèn)識(shí)〔7〕。Park等〔8〕將基因修飾的骨髓MSCs輸注到健康雌鼠體內(nèi)，通過建立帕金森病動(dòng)物模型觀察骨髓MSC對(duì)黑質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)酪氨酸羥化酶免疫活性陽性的黑質(zhì)神經(jīng)元在治療組明顯高于對(duì)照組。Harvey等〔9〕研究認(rèn)為，BMSCs可被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，遷移至病變部位，產(chǎn)生數(shù)種神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體，可有助于損傷脊髓神經(jīng)元的修復(fù)，抑制不利于神經(jīng)再生的瘢痕形成。王振宇等〔10〕將經(jīng)過堿性纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子修飾的BMSCs移植到損傷脊髓內(nèi)，發(fā)現(xiàn)可以極大地提高堿性纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平，并且能有效促進(jìn)大鼠脊神經(jīng)損傷后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。神經(jīng)干細(xì)胞可以通過連接脊髓損傷斷端，建立新的突觸聯(lián)系，同時(shí)在損傷處分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，改善脊髓損傷的微環(huán)境，促進(jìn)髓鞘再生，恢復(fù)神經(jīng)傳導(dǎo)。因此干細(xì)胞移植成為了當(dāng)前國際醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)，為人類神經(jīng)疾病的治療帶來了希望〔11〕。

NGF是一類已被證實(shí)的能夠促進(jìn)和維持神經(jīng)生長(zhǎng)、生存、分化和執(zhí)行功能的特種蛋白，還可挽救損傷的神經(jīng)元〔12〕。通過基因轉(zhuǎn)移NGF的研究證實(shí)，在成年鼠脊髓損傷后，NGF能誘導(dǎo)感覺神經(jīng)元和去甲腎上腺素能神經(jīng)元軸突延伸，使病灶局部運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元纖維發(fā)芽〔13〕。外源性NGF注橫斷性脊髓損傷局部，可導(dǎo)致皮質(zhì)脊髓束軸突的密度顯著增高〔14〕。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中重要成員，它與NGF有50%同源性〔15〕，不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中對(duì)維持神經(jīng)元正常的生理功能等方面起重要作用，還可誘導(dǎo)神經(jīng)突起定向生長(zhǎng)，決定感覺和交感神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)方向，同時(shí)具有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維營養(yǎng)活性，能保護(hù)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在脊髓損傷后免于死亡。Li等〔16〕研究指出，BDNF對(duì)多種神經(jīng)元的發(fā)育分化與生長(zhǎng)再生具有維持和促進(jìn)作用，還可阻止坐骨神經(jīng)橫切后大量運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的死亡，且能挽救脊髓半切傷后的紅核神經(jīng)元。由此可見，NGF和BDNF是干預(yù)神經(jīng)修復(fù)的機(jī)制的重要物質(zhì)，對(duì)神經(jīng)成長(zhǎng)與修復(fù)的效果有著重要的影響，也就是說NGF和BDNF物質(zhì)表達(dá)的好壞，可以直接影響著神經(jīng)修復(fù)的效果。

脊神經(jīng)損傷模型大鼠的腿部運(yùn)動(dòng)功能正與其脊神經(jīng)的損傷有關(guān)，脊神經(jīng)修復(fù)的好壞直接影響其腿部的運(yùn)動(dòng)功能。而NGF和BDNF是干預(yù)神經(jīng)修復(fù)機(jī)制的重要物質(zhì)，其充分表達(dá)可以促進(jìn)脊神經(jīng)損傷大鼠神經(jīng)元的存活、再生及其脊神經(jīng)的再生與修復(fù)，對(duì)神經(jīng)是否能夠得到良好成長(zhǎng)與修復(fù)起著重要的影響與制約作用。本文說明BMSCs移植有利于NGF和BDNF蛋白的表達(dá)，而神經(jīng)因子的顯著表達(dá)有利于促進(jìn)大鼠受損脊神經(jīng)組織細(xì)胞的再生、成長(zhǎng)與修復(fù)。所以，移植組大鼠腿部運(yùn)動(dòng)功能的康復(fù)更多的得益于BMSCs對(duì)NGF和BDNF的誘導(dǎo)進(jìn)而促進(jìn)其脊神經(jīng)功能的修復(fù)。

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