許榮華 何冬雷 孟 津 夏立平 王 健

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胃腸腫瘤外科，海南 ?？?570102)

有研究表明微小RNA(miRNA)與干細(xì)胞的自我更新、多能性的維持、分化和分裂增殖等過程有關(guān)〔1，2〕。臨床研究發(fā)現(xiàn): 在肝臟損傷、肝硬化、肝細(xì)胞癌(HCC)這一遞進(jìn)式過程中,卵圓細(xì)胞大量增殖并參與肝臟損傷的修復(fù)，是否說明卵圓細(xì)胞與肝癌細(xì)胞間有必然的聯(lián)系，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為肝內(nèi)卵圓細(xì)胞(HOCs)為HCC的起源細(xì)胞〔3〕，且國內(nèi)有研究證明使用3′-甲基-4-二甲基偶氮苯(3′-Me-DAB)所得的卵圓細(xì)胞與肝癌的發(fā)生有著密切的聯(lián)系〔4〕。本研究采用哺乳動物miRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)檢測兩種不同模型來源的大鼠肝卵圓細(xì)胞的miRNA，篩選出兩種不同來源的卵圓細(xì)胞的差異表達(dá)miRNA，以發(fā)現(xiàn)可能參與調(diào)控卵圓細(xì)胞分化為肝癌細(xì)胞的相關(guān)microRNA, 從而為闡明并掌控卵圓細(xì)胞向肝癌細(xì)胞分化的microRNA調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級健康的雄性Wistar 大鼠40只,體重(120±20)g,由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供(動物合格證號：2002-2009，2004B023，2004A068),大鼠按標(biāo)準(zhǔn)實驗室動物要求, 正常飼料喂養(yǎng)。

1.2試劑 2- 乙酰氨基芴(AAF)、表皮生長因子(EGF)、DMEM高糖、DMEM/F12 培養(yǎng)基和膠原酶Ⅳ均購自美國Sigma 公司，干細(xì)胞因子(SCF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)和白血病抑制因子(LIF) 購自Cytolab/Peprotech Asia 公司。3′-Me-DAB(日本東京化成工業(yè)株氏會社),小鼠抗大鼠c-kit單克隆抗體、Thy-1單克隆抗體(Santa Cruz, USA), FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠Ig 抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供,胎牛血清、F12、Hank液、PBS(廣州威佳責(zé)任有限公司)。 mirVanaTM miRNA Isolation Kit(Ambion, USA)，miRNA Complete Labeling and Hyb Kit(Agilent)。DNA抽提試劑盒、Taq DNA聚合酶(1.667×108nkat/L)( 北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.3大鼠HOCs增殖模型的建立 HOCs/AAF增殖模型：取20只♂Wistar大鼠穩(wěn)定飼養(yǎng)1 w后，將AAF 溶于植物油中，每日下午灌胃1 次，按20 mg·kg-1·d-1連續(xù)喂養(yǎng)6 d。第7天在乙醚持續(xù)吸入麻醉下施行左肝切除術(shù)或2/3肝切除術(shù)。第8天繼續(xù)喂養(yǎng)AAF(劑量同術(shù)前)，至第14天結(jié)束，然后于術(shù)后第12天在全麻下再次經(jīng)上腹正中切口入腹，迅速切取剩余肝臟，放人冰D-Hank 液中漂洗備用。參照文獻(xiàn)〔5〕，用眼科剪剪碎肝組織成0.1 cm2見方組織塊，冰D-Hank 液洗后，將肝組織放入2 ml含0.10% 膠原酶Ⅳ 和0.025%EDTA 的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)剪碎肝組織，倒入50 ml三角燒杯。加上述消化液8 ml，在37℃水浴振洗15 min，100目濾器過濾，殘存組織按上述消化過程重復(fù)進(jìn)行1、2次。細(xì)胞懸液4℃離心5 min。上清液經(jīng)4℃離心10 min。沉淀的細(xì)胞用2 ml DMEM 培養(yǎng)基懸浮，加入50 ml含0.10% Pronase E 和0.005% DNase I 的DMEM 培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)30 min。細(xì)胞懸液4℃離心10 min。細(xì)胞用2 ml D-Hank液懸浮。參照Sirica等〔6〕介紹的Percoll 密度梯度離心法進(jìn)行HOCs分離。2 ml DMEM懸浮細(xì)胞,接種于含20%小牛血清、20 g/mlEGF及各種氨基酸的DMEM/F12培養(yǎng)液。在37℃、50 ml/L CO2孵箱中培養(yǎng)〔7〕。

HOCs/DAB 增殖模型：20只Wistar 大鼠穩(wěn)定飼養(yǎng)1 w后, 改喂含0.06% 3′-Me-DAB的飼料，飼養(yǎng)溫度28℃, 濕度40%～70%。4 w后切除肝臟提取分離HOCs，步驟同上。

新分離的HOCs/AAF和HOCs/DAB細(xì)胞用0.25%臺盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞活力并進(jìn)行干細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定。臺盼藍(lán)染色細(xì)胞活力達(dá)95%。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml，接種于血清培養(yǎng)基。

1.4HOCs的鑒定和惡性分化 ①激光共聚焦掃描顯微鏡(LSCM)觀察:細(xì)胞爬片,0.01 mol/L PBS 漂洗1 min×3,4℃下4%PFA 固定15 min , 0.01 mol/L PBS 漂洗3 min×3;加入一抗(小鼠抗大鼠Thy-1單抗和C-kit 單抗) ,4℃過夜,洗滌5 min×4,移入適當(dāng)稀釋度的熒光素FITC標(biāo)記抗體二抗, 4℃孵育數(shù)小時,避光洗滌5 min×4,室溫下封片,避光保存。在LSCM下進(jìn)行熒光素抗體標(biāo)記的圖像采集、合并和分析,激發(fā)波長為488 nm,發(fā)射波長為504 nm。胞質(zhì)和胞膜呈綠色為陽性。②前10代每2代觀察一次，自第10代開始，每5代觀察一次，并提取miRNA。

1.5基因芯片檢測 取生長良好的HOCs/DAB與HOCs/AAF細(xì)胞提取總RNA，并對RNA進(jìn)行濃縮、定量、質(zhì)檢。用PEG 方法對miRNA 進(jìn)行分離。采用美國 Affymetrix 的 GeneChip miRNA 2.0Array(miRNA定量平臺)進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析：選擇FlashTag Biotin RNA Labeling Kit(美國Genisphere公司)對1 μg miRNA 進(jìn)行生物素標(biāo)記，隨后按照 Affymetrix 的操作說明(Fluidics Protocol FS450_0003)進(jìn)行芯片雜交、洗脫、圖像掃描及數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。判斷miRNA差異表達(dá)的篩選標(biāo)準(zhǔn): 耐藥細(xì)胞組與親本細(xì)胞組的檢測結(jié)果比值>1.5(上調(diào)1.5倍)或<0.67(下調(diào)1.5倍)，認(rèn)為miRNA再耐藥株與親本細(xì)胞之間有差異性表達(dá)；如差異倍數(shù)>2.0 或<0.5，認(rèn)為miRNA表達(dá)差異顯著。

1.6實時熒光定量PCR 采用TRIzol一步法提取HOCs/AAF和HOCs/DAB細(xì)胞的RNA, 具體步驟見Invitrogen公司的操作法。以1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 操作步驟見Fermentas公司的逆轉(zhuǎn)錄體系配置法。將逆轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物cDNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR，采用Bio-toyobo公司的SYBR Green實時定量PCR試劑盒，進(jìn)行兩步法擴(kuò)增，10 μl反應(yīng)體系：2×SYBR Real-time PCR Premixture 5 μl，正向引物0.3 μl(300 nm)，反向引物0.3 μl(300 nm)，cDNA 2 μl，雙蒸水2.4 μl。反應(yīng)條件：退火溫度60℃；95℃變性2 min；95℃，15 s，55℃，30 s。重復(fù)40個循環(huán)。65℃～95℃繪制溶解曲線。 microRNA引物直接采用贏潤生物的miRNA引物套裝，根據(jù)擴(kuò)增的目的miRNA和管家基因U6的Ct值，計算出擴(kuò)增的目的miRNA相對于管家基因U6的變化倍數(shù)。兩株細(xì)胞擴(kuò)增的目的miRNA相對于管家基因U6的變化倍數(shù)之比即是相對定量的結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1激光共聚焦掃描顯微鏡結(jié)果 HOCs胞質(zhì)和胞膜表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物Thy-1及C-kit(見圖1)。

Thy-1 C-kit

2.2HOCs的生長速度及倍增時間 HOCs呈多角型, 橢圓形或圓形。在體外培養(yǎng)傳代后, 繁殖速度加快, 細(xì)胞質(zhì)逐漸增多，并分化為圓形的肝癌細(xì)胞和細(xì)長紡錘樣膽管細(xì)胞。細(xì)胞的群體倍增時間逐漸延長。見圖2。

圖2 HOCs細(xì)胞生長形態(tài)

2.3HOCs/AAF和HOCs/DAB細(xì)胞差異表達(dá)miRNA 抽提HOCs/AAF和HOCs/DAB細(xì)胞中的總RNA，通過紫外分光光度計定量和瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，RNA的A260/280比值介于1.89～2.02，提取的總RNA無明顯降解，條帶清晰，RNA質(zhì)量符合miRNA 芯片檢測的要求(圖3)。經(jīng)芯片檢測發(fā)現(xiàn)，與HOCs/AAF細(xì)胞比較，HOCs/DAB細(xì)胞中有23個差異表達(dá)的miRNA，其中10個microRNA表達(dá)上調(diào)，8個microRNA表達(dá)下調(diào)(見表1)。

圖3 抽提HOCs/DAB和HOCs/AAF細(xì)胞總RNA電泳圖

表1HOCs/DAB和HOCs/AAF細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA

表達(dá)上調(diào)microRNAHOCs/DABHOCs/AAF表達(dá)下調(diào)microRNAHOCs/DABHOCs/AAFhsa-mir-3022.79 hsa-mir-1490.636 4hsa-miR-92b1.73 hsa-mir-31950.622 6hsa-mir-12811.70 hsa-mir-210.621 4hsa-mir-18251.65 hsa-mir-7620.615 7hsa-mir-4211.60 hsa-mir-1260b0.610 1hsa-mir-1001.59 hsa-mir-4830.595 7hsa-mir-6151.54 hsa-mir-12280.539 2hsa-mir-2121.53 hsa-mir-1810.528 8hsa-mir-1321.52 hsa-mir-3241.51

圖4 差異miRNAs在HOCs/AAF和HOCs/DAB細(xì)胞中的相對表達(dá)水平

2.4對芯片篩查差異表達(dá)顯著的代表性基因的驗證結(jié)果 圖4可見，挑選差異顯著且信號強度較高的miRNA進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測驗證，包括在HOCs/DAB細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的has-miR-1281、has-miR-92b、has-miR-302和表達(dá)下調(diào)的has-miR-1228、has-miR-181。采用U6作為內(nèi)參進(jìn)行歸一化。每條miRNA重復(fù)進(jìn)行三次熒光定量RT-PCR檢測。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示：has-miR-1281，has-miR-92b，has-miR-302在HOCs/DAB細(xì)胞中較HOCs/AAF細(xì)胞表達(dá)上調(diào)；has-miR-1228，has-miR-181在HOCs/DAB細(xì)胞表達(dá)下調(diào)，與芯片檢測結(jié)果基本一致。

3 討 論

miRNA為22個左右核苷酸的小分子RNA, 具有強大的調(diào)控功能, 成為當(dāng)前研究的熱點。miRNA與目的基因3′非編碼區(qū)(3′UTR)結(jié)合降解mRNA和抑制其翻譯, 控制著細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等重要的生命活動, 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔8，9〕；miRNA在腫瘤干細(xì)胞的“干性”相關(guān)基因和信號通路調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用, 被稱為Stem Cells miRNAs〔10〕。例如: miR-135a和miR-135b家族在結(jié)腸腺瘤和腺癌中表達(dá)上升, 他們調(diào)控著APC基因的表達(dá), 并參與Wnt信號通路的激活, 在結(jié)腸癌干細(xì)胞中發(fā)揮重要作用〔11〕。let-7在乳腺癌干細(xì)胞中表達(dá)缺失, 從而導(dǎo)致它負(fù)性調(diào)控的HMGA2基因高表達(dá), 而后者對于乳腺癌干細(xì)胞的自我更新發(fā)揮著重要作用〔12〕。miR-34家族在胰腺癌中低表達(dá),通過靶向Bcl-2、HMGA2和Notch等信號通路在胰腺癌干細(xì)胞中起抑制作用〔13〕。

雖然缺乏直接的證據(jù)，但越來越多的實驗結(jié)果支持肝癌起源于肝干細(xì)胞“成熟受阻”的觀點。Dumble等〔14〕對敲除p53 基因的小鼠喂缺乏膽堿卻補充乙硫氨酪酸的飲食，從而誘導(dǎo)HOCs大量增生，隨后分離出HOCs進(jìn)行培養(yǎng)后，將這些細(xì)胞接種于裸鼠皮下后長出與HCC相似的腫瘤，并確定其由HOCs分化而來，該細(xì)胞種植成瘤實驗提示HOCs可能參與HCC的發(fā)生。Grozdanov 等〔15〕報道癌胚蛋白Gpc3 可以作為肝祖細(xì)胞的標(biāo)志物，并通過建立Solt - farber 肝癌模型研究證實肝祖細(xì)胞/HOCs與HCC的發(fā)生有關(guān)。最近研究在HCC組織中具有干細(xì)胞特征的EpCAM + 細(xì)胞引導(dǎo)了肝癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步提示肝干細(xì)胞與HCC的發(fā)生有著密切的聯(lián)系〔16〕。

Terris等〔17，18〕發(fā)現(xiàn)：在高表達(dá)上皮細(xì)胞黏附分子EpCAM且甲胎蛋白陽性的癌細(xì)胞中，miR-181家族表達(dá)上升，而這類細(xì)胞通常被認(rèn)為是HCC的腫瘤干細(xì)胞。轉(zhuǎn)染miR-181后，發(fā)現(xiàn)EpCAM表型的癌細(xì)胞增多。miR-181能激活腫瘤信號途徑Wnt/β-catenin，并抑制一些促分化分子。調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的COX2、GATA6，以及抑制Wnt/β-catenin通路的激酶NLK是miR-181的直接靶點，使它們沉默能導(dǎo)致EpCAM +癌細(xì)胞數(shù)量增加。這些說明miR-181對維持HCC干細(xì)胞EpCAM表型即其“干性”具有重要意義。與我們的研究結(jié)果相似，Card 等〔19〕研究也發(fā)現(xiàn)，多能性因子 Oct4/Sox2 結(jié)合在 miR-302 的啟動子上，可以上調(diào) miR-302 的表達(dá)，miR-302 可直接作用于細(xì)胞周期調(diào)控蛋白 Cyclin D1 和 D2，過表達(dá) miR-302 可使 S期延長，G1期縮短。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-92b 可抑制細(xì)胞周期抑制因子 p57 的翻譯，促進(jìn)胚胎干細(xì)胞迅速通過G1/S 限制點〔20〕。由此可以推論，干細(xì)胞特異性miRNAs可促進(jìn)干細(xì)胞通過G1/S限制點，保持其快速增殖的特性。上述篩選的差異miRNAs可能參與HCC干細(xì)胞的“干性”, 有深入研究的價值。

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