石雁冰 張?zhí)m舉 邢立志 張媛媛 馬桂潔 李樹法

(貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院門診部，貴州 貴陽 550002)

1型糖尿病(T1DM)是由淋巴細胞介導(dǎo)的以胰島β 細胞特異性損傷導(dǎo)致胰島素生成絕對不足為特征的一種自身免疫性疾病〔1, 2〕。目前T1DM以胰島素終身替代療法和非特異性免疫抑制為主要治療手段，其費用高昂且副作用大，急需尋找一種特異性免疫干預(yù)策略〔3, 4〕。研究表明，誘導(dǎo)自身反應(yīng)性CD8+T細胞的免疫耐受是一種有效的T1DM治療策略，可減緩甚至完全阻斷T1DM的發(fā)生和發(fā)展〔5, 6〕。含V-set和免疫球蛋白域4(VSIG4)是一種新發(fā)現(xiàn)的B7家族相關(guān)蛋白，具有抑制T細胞活化的作用，是一個有力的T細胞活化負調(diào)節(jié)分子〔7〕。在本實驗中，制備VSIG4腺病毒，并觀察對NOD小鼠的CD8+T 細胞的抑制效應(yīng)和血糖水平的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1材料 8月齡NOD小鼠購自北京醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。重組VSIG4 (Ad-VSIG4) 腺病毒和攜帶β-半乳糖苷酶(LacZ) 基因的重組腺病毒(Ad-LacZ) 由上海生工制備。CD8+T 細胞分離試劑盒購自Miltenyi 公司。ELISPOT檢測干擾素(IFN)-γ試劑盒購于法國DIACLONE公司。其他為常用試劑。

1.2動物免疫 分別用含1×109pfu的Ad-VSIG4或Ad-LacZ的重組腺病毒及磷酸鹽緩沖液(PBS)分三組免疫8月齡NOD小鼠。背側(cè)尾根部皮下注射3次，間隔1 w。

1.3小鼠脾臟淋巴細胞懸液制備 NOD小鼠最后一次免疫后1 w，頸椎脫臼法處死小鼠，無菌分離小鼠脾臟放于冷Hank液中，剪碎并反復(fù)碾磨通過200目的無菌銅網(wǎng)，收集懸液并用紅細胞溶解液去除紅細胞，再用大量Hank's 液洗滌細胞2次，1 200 r/min離心10 min，用RPMI1640培養(yǎng)液重懸，計數(shù)。

1.4免疫磁珠分選(MACS) 純化CD8+T細胞 取4×107細胞，1 200 r/min 離心10 min，去上清液后用160 μl 緩沖液重懸，加40 μl 抗體Cocktail 充分混勻，4℃孵育10 min。加160 μl緩沖液，1 200 r /min離心10 min，去上清液，再加入320 μl 緩沖液、80 μl磁性微珠，充分混勻，4℃孵育15 min。用適量緩沖液沖洗，1 200 r /min離心10 min。吸除上清液，用500 μl 緩沖液重懸細胞， 200 目篩網(wǎng)過濾成無氣泡的單細胞懸液。將MACS細胞分離柱置于MACS 磁力架上，先用500 μl 緩沖液洗柱，再將細胞懸液通過MACS 柱，1 500 μl 緩沖液洗滌，收集流出液體，離心收集細胞，計數(shù)。

1.5ELISPOT檢測 參照ELISPOT(IFN-γ)試劑盒使用說明書進行檢測。調(diào)整細胞為1×106個/ml，于96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μl細胞懸液，各設(shè)3個復(fù)孔，孵育48 h。陰性對照不加細胞孵育，計數(shù)各孔出現(xiàn)的色斑數(shù)目。

1.6淋巴細胞增殖能力檢測 調(diào)整細胞為1×106個/ml,于96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μl細胞懸液，加入終濃度為IFN 100 μg/ml的insulin蛋白，培養(yǎng)72 h。每孔再加入0.1 ml濃度為1×103μCi/L的3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR) 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用PBS漂洗細胞3次，甲醛固定10 min，再用4℃預(yù)冷的體積分數(shù)為5%的三氯醋酸溶液漂洗3次，每孔加入0.5 ml濃度為0.3 mol/L的NaOH溶液，60℃水浴反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移入閃爍瓶中，加入5 ml 閃爍液，用液體閃爍計數(shù)器計數(shù)每分鐘的閃爍次數(shù)(cpm)，測定DPM 值(反映細胞DNA 合成速率)，重復(fù)測定3 次。

1.7NOD小鼠血糖水平檢測 NOD小鼠最后一次免疫后1 w, 每2 w檢測血糖濃度，當(dāng)連續(xù)2次的血糖濃度>11.1 mmol/L時，定義為糖尿病。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10. 0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1ELISPOT檢測結(jié)果 實驗組小鼠CD8+T細胞的IFN-γ分泌數(shù)量為(44±6)個，而Ad-LacZ和PBS對照組的IFN-γ分泌數(shù)量為(99±14)個和(107±19)個。實驗證明VSIG4腺病毒能有效抑制NOD小鼠淋巴細胞的活化。

2.2淋巴細胞增殖結(jié)果 實驗組小鼠CD8+T細胞的cpm值為(36 700±2 900)，而Ad-LacZ和PBS對照組的cpm值為(50 600±5 700)和(53 500±6 600)。實驗證明VSIG4腺病毒能有效抑制NOD小鼠CD8+T細胞的增殖。

2.3血糖水平抑制結(jié)果 實驗組小鼠18周齡開始出現(xiàn)血糖異常，30周齡的糖尿病發(fā)病率為30%，而對照組小鼠12周齡開始出現(xiàn)血糖異常，30周齡的糖尿病發(fā)病率高達80%。實驗證實VSIG4腺病毒病能夠有效延遲NOD小鼠糖尿病的發(fā)病時間，并降低糖尿病的發(fā)病率。見圖1。

圖1 各實驗組NOD小鼠的糖尿病發(fā)病率

3 討 論

目前普遍認為T1DM是在遺傳和環(huán)境因素共同作用下，由T淋巴細胞介導(dǎo)的器官特異性自身免疫性疾病〔8, 9〕。主要是由于免疫系統(tǒng)的異常，CD4+和CD8+T淋巴細胞對胰島的浸潤，引發(fā)胰島炎癥并導(dǎo)致對胰島β細胞的損傷，使胰島素分泌絕對減少，引起體內(nèi)胰島素絕對缺乏從而導(dǎo)致血糖持續(xù)升高，產(chǎn)生T1DM〔10, 11〕。多種免疫機制參與T1DM的發(fā)病，為糖尿病的預(yù)防提供了途徑和方向。研究數(shù)據(jù)表明，應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)藥物和細胞等手段可以抑制胰島炎癥作用，減少β細胞的免疫破壞及凋亡，誘導(dǎo)特異性免疫耐受，從而達到預(yù)防及阻止糖尿病發(fā)病。

VSIG4又稱補體受體免疫球蛋白超家族分子CRIg，是一種新發(fā)現(xiàn)的B7家族相關(guān)蛋白。VSIG4的mRNA高表達于成人肺、胎盤、肝和心臟等組織，但VSIG4主要局限表達于巨噬細胞，在單核細胞中幾乎沒有表達，并且當(dāng)巨噬細胞受外來刺激活化后VSIG4表達下調(diào)〔12〕。既往研究發(fā)現(xiàn)，VSIG4是巨噬細胞上的補體受體，可結(jié)合補體C3的降解片段C3b和iC3b，對于病原體的吞噬起重要作用〔13〕。最近的研究顯示，VSIG4有抑制T細胞活化的作用，且作用強于PD-Ls/PD-1途徑，是一個有力的T細胞活化負調(diào)節(jié)分子〔14〕。但目前未有VSIG4抑制T1DM中CD8+T 細胞的活化的報道。

綜上所述，VSIG4腺病毒能抑制NOD小鼠體內(nèi)CD8+T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，為T1DM的免疫耐受誘導(dǎo)治療提供了理論依據(jù)。

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