黃 波 王曉東 郎賢平

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院胸外科，遼寧 錦州 121000)

小細(xì)胞肺癌(SCLC)是一種特殊類型的肺癌，占肺癌的15%～20%。SCLC侵襲性強(qiáng)，生長迅速且早期容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移〔1〕。雖然SCLC對化療和放療敏感，但它容易復(fù)發(fā)和耐藥。因此尋找SCLC的相關(guān)基因尤顯重要。富含AT-序列結(jié)合蛋白1(SATB1)是一種核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合蛋白，參與染色質(zhì)合成和組織特異性基因表達(dá)〔2〕。 SATB1主要表達(dá)在胸腺細(xì)胞其調(diào)控T細(xì)胞的發(fā)育與成熟〔3〕。 有報道顯示SATB1與乳腺癌的轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良有一定的相關(guān)性〔4〕。RNA干擾SATB1可引起侵襲性較強(qiáng)的癌細(xì)胞超過1 000個基因的表達(dá)改變，并能有效地抑制細(xì)胞的增殖，侵襲，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。SATB1-RNAi技術(shù)已證實其對于肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞的侵襲能力均有一定的抑制作用〔5～9〕，而在SCLC細(xì)胞中SATB1基因的干擾RNA的效果尚缺乏報道。本研究將針對SATB1-siRNA對SCLC的作用進(jìn)行初步探討。

1 材料和方法

1.1材料 人SCLC細(xì)胞株NCI-H446由中國科學(xué)院細(xì)胞庫引進(jìn)。新生小牛血清購于杭州四季青公司，RPMI-1640培養(yǎng)基和lipofect2000購于美國invitrogen公司。pRNAT-U6.1/Neo購于上海閃晶生物公司，大小6.4 kb。攜帶有綠色熒光蛋白報告基因，其兩端分別帶有BamH I和EcoR I.酶切位點。菌株JM109、DH5α均購于大連寶生物公司。引物設(shè)計、合成以及測序由大連寶生物公司完成。SATB1-siRNA-1，SATB1-siRNA-2為RNA干擾序列，SATB1-siRNA-N為無意義干擾序列。

1.2siRNA載體構(gòu)建 將合成的SATB1基因的siRNA引物si-1正義鏈：5'-GATCCCCGGATTTGGAAGAGAGTGTCTTCAAGAGAGACACTCTCTTCCAAATCCTTTTTGGAAA- 3'；反義鏈：5'-AGCTTTTCCAAAAAGGATTTGGAAGAGAGTGTCTCTCTT GAAGACACTCTCTTCCAAATCCGGG-3'；si-2正義鏈：5'-GATCCCCGTCCACCTTGTCTTCTCTCTTCAAGAGAGAGAGAAGACAAG GTGGACTTTTTGGAA A-3'反義鏈：5'-AGCTTTTCCAAAAAGTCCACCTTGTCTTCTCTCTCTCTTGAAGAGAGAAGACAAGGTGGAC GGG-3'；si-N正義鏈：5'-GATCCGCGAGACCTCAGTATGTTACCTGTGAAGTAACATACCACAGATGGGGCTGAGGTCTCGCTTTTTTG-3'。退火并將退火產(chǎn)物與RNAi-Ready pSIREN-DNR載體4℃過夜充分連接。熱轉(zhuǎn)化至DH5α中，分別命名為SATB1-siRNA-1，SATB1-siRNA-2，SATB1-siRNA-N，涂布平板后，37℃過夜培養(yǎng)。從轉(zhuǎn)化平板上挑取陽性單菌落，進(jìn)行擴(kuò)增，檢測陽性克隆，并測序。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，NCI-H446細(xì)胞用胰酶消化，接種于6 孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60%～70%融合時，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染當(dāng)天更換為無胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)孔1 000 μl。取lipofect2000 10 μl，按照轉(zhuǎn)染試劑∶DNA(μg)為10∶2 的比例加入構(gòu)建成功的載體DNA，混勻后室溫孵育30 min，加入到6孔板中培養(yǎng)，6 h后加入100 μl胎牛血清。轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染成功后檢測各項指標(biāo)。

1.4Western印跡鑒定沉默效果 收取部分細(xì)胞，加入預(yù)冷裂解緩沖液，剪碎，超聲勻漿，低溫超速離心。吸取上清液，Lowry法測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠90 V 電泳3 h 后轉(zhuǎn)印。洗膜后1%BSA封閉非特異性抗原2 h。緩沖液洗膜，與一抗(1∶250)4℃孵育過夜。洗膜后與堿性磷酸酶標(biāo)記二抗(1∶200)室溫下孵育2 h。NBT/BCIP顯色，以NC膜上出現(xiàn)清晰的棕褐色條帶為陽性，終止顯色，漂洗并干燥后避光保存。

1.5細(xì)胞增殖能力的檢測(MTT法) 用0.25%的胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后24 h的4組細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染組、SATB1-siRNA-1組、SATB1-siRNA-2組及SATB1-siRNA-N組)，以含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液配置成單細(xì)胞懸液。以每孔2×103個細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積0.2 ml，每組細(xì)胞接種6個孔，并以培養(yǎng)液為空白對照，以接種后24、48、72、96 h為4個觀察時間點，共鋪4塊板。置37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h后取出其中一塊板，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl， 37℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清后每孔加入150 μl DMSO，并震蕩10 min使MTT充分溶解。用490 nm波長的酶標(biāo)儀，測定各孔的吸光度值(OD值)。

1.6轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力的檢測 將轉(zhuǎn)染后24 h四組細(xì)胞進(jìn)行如下操作：水化后的Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中，在小室外加含15%胎牛血清1640培養(yǎng)液500 μl，在小室內(nèi)加入200 μl腫瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為5×103，培養(yǎng)液為含2%胎牛血清1640培養(yǎng)液，每組重復(fù)6個樣本。常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉簽小心擦去微孔膜上層細(xì)胞，HE溶液染色。在顯微鏡下計數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞數(shù)，每個樣本計數(shù)10個視野。

1.7流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡 將轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-1、SATB1-siRNA-2及SATB1-siRNA-N 48 h的NCI-H446細(xì)胞未轉(zhuǎn)染的NCI-H446細(xì)胞在孵育24 h后收集，70%冰乙醇固定1 h，冷PBS洗2次，計數(shù)約1×104個細(xì)胞，重懸于200 μl binding Buffer，10 μl PI(50 mg/ml)，輕輕混勻，室溫避光處放置15 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行t檢驗及χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染結(jié)果判定 因構(gòu)建的siRNA載體含有綠色熒光蛋白，轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-1、SATB1-siRNA-2、 SATB1-siRNA-N后，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核膜及胞質(zhì)內(nèi)可見綠色的熒光(圖1,圖2)，未轉(zhuǎn)染組無熒光表達(dá)，表明成功將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入NCI-H446細(xì)胞。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后NCI-H446細(xì)胞略腫脹，部分細(xì)胞變圓，死亡，而轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-1、SATB1-siRNA-2后細(xì)胞的數(shù)量明顯少于轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-N和空白對照組。

圖1 轉(zhuǎn)染siRNA-1的NCI-H446細(xì)胞(×100)

2.2SATB1-siRNA對SATB1蛋白表達(dá)的影響 Western印跡檢測SATB1蛋白表達(dá)水平，可見 86 kD處一條特異條帶。凝膠成像系統(tǒng)灰度掃描 SATB1現(xiàn)色條帶，轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2組與轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-N和空白對照組相比，SATB1蛋白表達(dá)量明顯下降(圖3)。

圖2 轉(zhuǎn)染siRNA-1的NCI-H446細(xì)胞(×100)

1為空白對照組，2為轉(zhuǎn)染siRNA-1組，3為轉(zhuǎn)染siRNA-N組，4為轉(zhuǎn)染siRNA-2組

2.3轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖能力的改變 轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2的NCI-H446細(xì)胞的增殖(17.27±1.19和15.96±1.85)與轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA -N和空白對照組細(xì)胞相比較明顯受到抑制(9.07±1.36和11.81±1.65)。但轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-N和空白對照組細(xì)胞之間以及轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2組細(xì)胞沒有顯著的區(qū)別。見表1。

表1 不同組細(xì)胞吸光度值±s，n=5)

2.4轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡改變 細(xì)胞凋亡率SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞均顯著高于轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA -N和空白對照組細(xì)胞。

2.5轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力的檢測 轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2組在膜上的細(xì)胞數(shù)量(47±4和39±7)明顯少于轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA -N和空白對照組細(xì)胞數(shù)量(78±3和75±6,P<0.05)。但轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA -N和空白對照組細(xì)胞之間以及轉(zhuǎn)染SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2組細(xì)胞沒有顯著的區(qū)別(P>0.05)。

3 討 論

SCLC約占全部肺癌20%～25%，其惡性程度高、發(fā)展迅速、早期可有遠(yuǎn)處廣泛的轉(zhuǎn)移。SCLC對放化療敏感，近期療效好，但90%以上的患者治療后出現(xiàn)耐藥進(jìn)而導(dǎo)致復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而目前發(fā)現(xiàn)的與SCLC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因較為罕見〔10〕。尋找新的SCLC轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，并確定其在SCLC中的作用，對于SCLC的診斷和治療均具有一定的意義。

SATB1是一種組織特異性表達(dá)的核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合蛋白(MBP)，定位于3號染色體短臂2區(qū)3帶，全長763個氨基酸。早期研究顯示，SATB1參與胸腺細(xì)胞發(fā)育、T細(xì)胞的成熟和染色體高級結(jié)構(gòu)的形成。2008年，Han等在《Nature》上首次揭示了SATB1和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系，Han等在對細(xì)胞株和乳腺癌樣本的檢測中發(fā)現(xiàn)，SATB1表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞的侵襲性密切相關(guān)〔4〕。在隨后的體外實驗中，Han等應(yīng)用了RNA干擾的方法來下調(diào)SATB1的表達(dá)，結(jié)果使高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株MDA-MB-231和BT549的侵襲力大大下降。相反異位SATB1表達(dá)卻使非侵襲性細(xì)胞株SKBR3獲得了侵襲力。這些都提示，SATB1是乳腺癌細(xì)胞獲得和維持侵襲力、乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。肝癌、直腸癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞的研究同樣顯示SATB1的過度激活及表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無限生長，抑制凋亡〔9，11，12〕。

本研究結(jié)果提示SATB1可能會成為治療SCLC一個理想的目標(biāo)基因。轉(zhuǎn)移是實體瘤發(fā)展的最終步驟，是癌癥患者死亡的最常見的原因?？刂颇[瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，可以提高癌癥患者的存活率，而SATB1在腫瘤的浸潤和遷移過程中起著重要的作用，本研究結(jié)果與該方面其他腫瘤的研究基本相一致。本研究結(jié)果還表明，轉(zhuǎn)染SATB1的siRNA后，SCLC細(xì)胞的增殖能力明顯下降。關(guān)于SATB1影響SCLC的增殖和侵襲的機(jī)制為何? 該方面的研究相對較少，但乳腺癌方面的研究顯示，SATB1改變了涉及腫瘤發(fā)生的多個方面的1 000余個基因的表達(dá)。在與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因方面，SATB1上調(diào)了許多促轉(zhuǎn)移基因，包括在轉(zhuǎn)移和血管發(fā)生中起作用的metastasin(S100A4)和VEGFB，降解細(xì)胞外基質(zhì)和促進(jìn)腫瘤侵襲的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、3和9，刺激侵襲的轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFB1)，以及血管發(fā)生和骨轉(zhuǎn)移的結(jié)締組織生長因子(CTGF)。相反，SATB1下調(diào)了轉(zhuǎn)移抑制基因BRMS1、KAI1(CD82)、KISS1和NME1(NM23)。SATB1這種核基質(zhì)結(jié)合蛋白擔(dān)任了基因組組織者的角色，它顯著地改變了乳腺癌細(xì)胞的基因表達(dá)譜，誘導(dǎo)其出現(xiàn)侵襲性表型，從而促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。將進(jìn)一步研究其在SCLC細(xì)胞的具體機(jī)制。

總之，本研究顯示SATB1可調(diào)節(jié)的SCLC細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡，這可能會為因SATB1異常而引起的SCLC以及其他癌癥提供重要線索。

4 參考文獻(xiàn)

1黃 波，王曉東，郞賢平.ABCE1基因?qū)π〖?xì)胞肺癌增殖、侵襲、遷移能力的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013；33(1)：119-21.

2Nakayama Y,Mian IS,Kohwi-Shigematsu T，etal.A nuclear targeting determinant for SATB1,a genome organizer in the T cell lineage〔J〕.Cell Cycle，2005；4(8):1099-106.

3Nie H,Yao X,Maika SD，etal.SATB1 is required for CD8 coreceptor reversal〔J〕.Mol Immunol，2008；46(1):207-11.

4Han HJ,Russo J,Kohwi Y，etal.SATB1 reprogrames gene expression to promote breast tumour growth and metastasis〔J〕.Nature，2008；452(7184):187-93.

5Cheng C,Lu X,Wang G,etal.Expression of SATB1 and heparanase in gastric cancer and its relationship to clinicopathologic features〔J〕.Acta，2010；118(11):855-63.

6Lu X,Cheng C,Zhu S,etal.SATB1 is an independent prognostic marker for gastric cancer in a Chinese population〔J〕.Oncol Rep，2010；24(4):981-7.

7Tu W,Luo M,Wang Z，etal.Upregulation of SATB1 promotes tumor growth and metastasis in liver cancer〔J〕.Liver Int，2012；32(7):1064-78.

8Chu SH,Ma YB,Feng DF，etal.Upregulation of SATB1 is associated with the development and progression of glioma〔J〕.J Transl Med，2012；10(1):149.

9Nodin B,Johannesson H,Wangefjord S，etal.Molecular correlates and prognostic significance of SATB1 expression in colorectal cancer〔J〕.Diagn Pathol，2012；7(1):115.

10Bo Huang,Ying Gao,Dali Tian.A Small interfering ABCE1-targeting RNA inhibited the proliferation,invasiveness of small cell lung cancer〔J〕.Int J Molecul Med,2010；25(4)：687-93.

11Meng WJ,Yan H,Zhou B，etal.Correlation of SATB1 overexpression with the progression of human rectal cancer〔J〕.Int J Colorectal Dis，2012；27(2):143-50.

12Zheng J.Is SATB1 a master regulator in breast cancer growth and metastasis〔J〕? Womens Health(Lond Engl)，2008；4(4):329-32.