楊吉平 費 琳 張軍峰 趙朝華 徐 曦

(西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，陜西 西安 710021)

阿爾茨海默病(AD)最顯著的神經(jīng)組織病理學(xué)特征是神經(jīng)細胞之間存在大量的老年斑(SP)和神經(jīng)細胞內(nèi)存在神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)。關(guān)于AD 的發(fā)病機制有淀粉樣蛋白(Aβ)級聯(lián)假說、tau 蛋白異常假說、凋亡假說、膽堿能假說以及自由基損傷假說等，但其確切的發(fā)病原因目前還不十分明確。小檗堿又稱黃蓮素，是從毛茛科植物黃連、三角葉黃、云連的干燥根莖中提取的一種異喹啉類生物堿，是我國歷史悠久的傳統(tǒng)藥物的主要成分，臨床上主要用于治療胃腸道疾病。近年來隨著對小檗堿藥效作用的深入研究，發(fā)現(xiàn)小檗堿在體內(nèi)、外均具有抑制多種腫瘤細胞增殖的作用〔1〕。此外，小檗堿對于治療神經(jīng)退行性疾病的潛力越來越受到關(guān)注〔2，3〕。本實驗用Aβ25～35誘導(dǎo)損傷原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元，復(fù)制AD 細胞模型，觀察小檗堿的神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基購自武漢博士德生物工程有限公司，胰蛋白酶購自Beyotime 公司，噻唑藍(MTT)購自Amresco公司，Aβ25～35及阿糖胞苷購自Sigma 公司，Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海美季生物技術(shù)有限公司，兔抗大鼠Cleaved caspase-3(Asp175)購自Cell Signaling Technology、抗 β-actin 及山羊抗兔IgG (FITC) 購自Santa Cruz公司，小檗堿購自中國藥品生物制品檢驗所 (批號：1107132200218)。

1.2大腦海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng) 取出生24 h Wistar大鼠，用75%乙醇浸泡消毒，無菌條件下分離出海馬組織，置于冰浴 PBS 液中，小心剔除血管及筋膜，用PBS 液沖洗干凈，剪碎。然后加入30倍組織體積的2.5 g/L胰蛋白酶液，37 ℃振蕩消化15 min，F(xiàn)BS液終止消化，過75 μm篩網(wǎng)。1 000 r/min離心10 min，收集細胞，加入15 ml 種植液(DMEM/F12+10%胎牛血清)重懸，以1×106個細胞將海馬神經(jīng)元接種于涂有多聚賴氨酸的 96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，置37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以接種當天為培養(yǎng)第1天，至培養(yǎng)第3天加入終濃度為10 μmol/L 的阿糖胞苷以抑制非神經(jīng)元的增殖，細胞培養(yǎng)液隔日半量換液，培養(yǎng)7 d 后用于各項實驗。

1.3分組及藥物干預(yù) 實驗分為對照組、模型組、小檗堿1、2、4 μmol/L組。將海馬神經(jīng)元正常培養(yǎng)7 d 后，加入Aβ25～35使其終濃度為25 μmol/L，作用36 h，復(fù)制AD細胞模型，預(yù)先或同時按以上不同濃度加入小檗堿作用。對照組以等量的培養(yǎng)液代替。

1.4細胞存活率檢測 用細胞增殖抑制試驗(MTT比色法)測定小檗堿對Aβ25～35復(fù)制AD細胞模型細胞存活的影響。在96 孔培養(yǎng)板中，給培養(yǎng)7 d 的大鼠海馬神經(jīng)元小檗堿組分別加入小檗堿1、2、4 μmol/L，對照組及模型組以等量含10%血清DMEM 培養(yǎng)基代替，培養(yǎng)24 h后倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)學(xué)變化。在模型組和小檗堿組分別加入終濃度為25 μmol/L 的Aβ25～35，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。每組設(shè)4個平行孔。在避光條件下，每孔加入MTT 20 μl(濃度為5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清后每孔加 DMSO 100 μl，37℃振蕩10 min，待紫色結(jié)晶充分溶解后，置于酶標儀上測波長為570 nm的吸光度(A)值。取4孔的均值計算細胞存活率。

1.5Annexin V/PI 雙標流式細胞法檢測小檗堿對AD模型神經(jīng)元早期凋亡的影響 原代培養(yǎng)神經(jīng)元種植于12孔板中，正常培養(yǎng)7 d后，加入Aβ25～35及小檗堿進行干預(yù)，共同作用36 h。離心、收集、懸浮細胞， 在細胞懸浮液中加入5 μl Annexin V-EGFP，輕輕混勻后在4 ℃避光條件下孵育15 min。 加入10 μl PI 后輕輕混勻于4 ℃避光條件下孵育5 min。在1 h內(nèi)通過流式細胞儀檢測小檗堿對AD 模型神經(jīng)元早期凋亡的影響。實驗重復(fù)3次。

1.6Western 印跡檢測小檗堿對AD 模型神經(jīng)元活化的Caspase-3蛋白表達的影響 原代培養(yǎng)神經(jīng)元種植于6 孔板中，正常培養(yǎng)7 d后，加入Aβ25～35及小檗堿進行干預(yù)，共同作用36 h。吸去培養(yǎng)液，用冰PBS洗滌2次，棄去洗液并吸干殘液；加入100 μl NP-40細胞裂解液 (pH7.4)，收集細胞于離心管中，在冰上裂解30 min，4℃，12 000 r/min，離心20 min；上清液轉(zhuǎn)至另一離心管中，采用Bradford 法蛋白定量。樣品與4 ×上樣緩沖液混合，煮沸5 min，取等量總蛋白上樣。以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，首先以85 V恒壓電泳，進入分離膠后將電壓調(diào)到120 V，直至溴酚藍前沿到達距底部約1 cm左右時，停止電泳。濕電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，TBS漂洗5 min×2次后，加入兔抗大鼠Cleaved Caspase-3抗體(1∶500)，4 ℃過夜，TBS漂洗10 min ×4次，加入1∶10 000辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h。TBS漂洗10 min ×4次，ECL發(fā)光法顯色，X-射線膠片曝光，蛋白表達條帶應(yīng)用Scoin Image 軟件進行灰度分析。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1MTT檢測結(jié)果 25 μmol/LAβ25～35與大鼠海馬神經(jīng)細胞共同培養(yǎng)36 h 后，其存活率較對照組下降了52.5%。預(yù)先加入1、2 μmol/L和4 μmol/L小檗堿可顯著提高細胞存活率至62.0%、67.6%和75.9%(P<0.05,P<0.01)，隨著劑量的增加，細胞存活率的提高有增強的趨勢。見表1。

2.2小檗堿對神經(jīng)元早期凋亡變化的影響 與對照組比較，模型組細胞早期凋亡率明顯升高(18.58%±10.03% vs 3.02%±1.04%，P<0.01)；與對照組比較，2 μmol/L及4 μmol/L小檗堿組細胞早期凋亡率明顯降低(13.31%±3.98%，P<0.05,4.93%±2.96%，P<0.01)。1 μmol/L小檗堿組凋亡率無明顯改變(17.74%±6.70%，P>0.05)。

2.3小檗堿對AD 模型神經(jīng)元 Cleaved Caspase-3 蛋白表達的影響 由圖1 可見，對照組細胞無活化的Caspase-3 蛋白表達，而模型組細胞Cleaved Caspase-3蛋白表達明顯；小檗堿組均能抑制異常活化的Caspase-3 蛋白表達。與β-actin 的光密度比值統(tǒng)計分析顯示，1 μmol/L、2 μmol/L和4 μmol/L小檗堿分別使Aβ25～35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元Cleaved Caspase-3蛋白表達降低了30.4%、41.2%和 63.1%。

表1 小檗堿對Aβ25～35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元光吸光度(A)值及細胞存活率的影響±s)

1～5：對照組，模型組，1、2、4 μmol/L小檗堿組

3 討 論

利用Aβ誘導(dǎo)小鼠或大鼠海馬及大腦皮層神經(jīng)元或PC12細胞建立AD 的細胞模型廣泛用于AD的實驗研究〔4〕。該實驗用濃度為 25 μmol/L的Aβ25～35與大鼠海馬神經(jīng)元共同培養(yǎng)36 h 較好地建立了AD 的細胞模型。

目前臨床上，在AD的治療中尚無特殊有效的藥物。減少Aβ的生成或拮抗Aβ 的毒性是一種很重要的治療策略。長期以來對小檗堿生化、藥理，臨床的研究，證明它是一種毒副作用小、具有廣泛用途的藥物，它除了具有抗菌、抗炎、抗瘧作用外，還具有抗心律失常、抗腫瘤等活性〔5〕。近年來有研究顯示，小檗堿對H2O2和6-羥基多巴胺損傷的PC12細胞發(fā)揮了明顯的抗氧化作用〔6，7〕，能減少花萼海綿體誘癌素A(calyculin-A)誘導(dǎo)的HEK293 細胞Tau蛋白的磷酸化水平〔8〕。另外也有研究表明，在雙側(cè)海馬注射Aβ1～40的AD模型大鼠中，小檗堿能夠明顯改善大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶缺陷，并能增加IL-1β 和誘生型一氧化氮合酶(iNOS)的表達〔9〕。本實驗發(fā)現(xiàn)不同濃度的小檗堿均能使AD 細胞模型神經(jīng)元細胞存活率明顯提高，4 μmol/L小檗堿能顯著減少Aβ25～35損傷神經(jīng)元早期凋亡。Caspase-3是所有細胞凋亡的最后執(zhí)行者，是細胞凋亡蛋白級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，隨著這種蛋白酶的激活，神經(jīng)元將不可逆性地發(fā)生凋亡〔10〕。本結(jié)果提示小檗堿能夠抑制Aβ25～35損傷的神經(jīng)元凋亡，拮抗Aβ 的毒性，具有一定的神經(jīng)保護作用。因此，小檗堿有望成為治療AD的一種藥物。

4 參考文獻

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