王丹丹 汲 軍 項(xiàng)柏冬

(長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031)

肝癌在腫瘤發(fā)病率中位列第三。確診時(shí)常常已到晚期,預(yù)后差,嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。常用的放化療手段有一定療效,但常給機(jī)體帶來(lái)嚴(yán)重的副作用。因此，尋找高效低毒的化療藥物，和毒副作用小的純中藥制劑來(lái)輔助治療肝癌成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。姜黃素(CUR)是從姜黃中提取的天然藥物成分，其藥理作用廣泛，主要有抗炎、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、脂質(zhì)過(guò)氧化、抗病毒等〔1〕。它具有毒副作用低、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。許多動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CUR可抑制胃癌、皮膚癌、結(jié)腸癌等癌癥的發(fā)生，具有明顯的抗腫瘤效果。本文主要研究CUR在體外對(duì)人肝癌細(xì)胞株(HepG-2)的抑制效果，探討CUR的抗腫瘤活性，以期為CUR的體內(nèi)活性及臨床應(yīng)用研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1儀器、試劑、藥品 Bio-RAD550全自動(dòng)酶標(biāo)儀：美國(guó)伯樂(lè)公司；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)5810R型：德國(guó)Eppendorf公司；二氧化碳培養(yǎng)箱：美國(guó)Forma公司；電子天平：北京賽多利斯有限公司；Olympus倒置相差顯微鏡：日本Olympus公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)：美國(guó)Sigma公司。RPMI-1640培養(yǎng)基：Gibco公司；小牛血清(FBS)：杭州四季青生物工程材料有限公司；無(wú)水二甲基亞砜(DMSO)：分析純，美國(guó)Sigma公司；胰酶：美國(guó)Sigma公司；吉姆薩染液：德國(guó)AppliChem公司；姜黃素(含量>80%)：美國(guó)Sigma公司。細(xì)胞株：HepG-2購(gòu)買(mǎi)于上海生物制品研究所，液氮中凍存保種。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG-2接種于含雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基并加入FBS培養(yǎng)，置于5%CO2飽和濕度、37.5℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種后72 h后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，用0.25%胰酶將貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用直接吹打法傳代，每1～2 d更換1次培養(yǎng)基，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CUR溶液的配制 將CUR粉劑用少量DMSO溶解，配成1 mmol/L儲(chǔ)備液，置于冰箱-20℃中儲(chǔ)存?zhèn)溆茫瑢?shí)驗(yàn)前解凍，用時(shí)稀釋至所需藥物濃度(DMSO終濃度<0.1%)。

1.2.3分組 空白對(duì)照組：加入0.1%DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)基和細(xì)胞；CUR組：共設(shè)6個(gè)濃度組(5，10，20，30，40，50 μg/ml)，每孔加入含0.1%DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)基、細(xì)胞和相應(yīng)濃度的CUR。

1.2.4MTT法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞株增殖的影響 取消化后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2，分別以濃度為1×104個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，加入量為200 μl/孔，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后加入上述分組濃度的CUR溶液，加藥量為200 μl/孔，每組設(shè)6個(gè)平行孔。作用48 h后，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，繼續(xù)孵育4 h。小心吸去培養(yǎng)基上清液，每孔再加入DMSO 150 μl振蕩混勻10 min，使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀選擇490 nm波長(zhǎng)，空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔吸光度A值，并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR) 。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，根據(jù)細(xì)胞IR判定藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。IR=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。

1.2.5集落形成試驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)增殖的抑制作用 貼壁細(xì)胞采用平板克隆法：按100/ml、1 ml/孔接種細(xì)胞于24孔板，待細(xì)胞貼壁24 h后，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的姜黃素(5，10，50 μg/ml)，對(duì)照組加入含0.1%DMSO的RPMI-1640培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，待培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的集落時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)小心浸洗2次。加甲醇0.5 ml/孔，固定15 min，棄去固定液，加2～3滴姬姆薩染液染色20～30 min，然后緩慢流水洗去染色液，空氣干燥。肉眼觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞集落(≥50 個(gè)細(xì)胞者計(jì)為一個(gè)集落)。按以下公式計(jì)算集落形成抑制率：集落形成抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組集落形成率/對(duì)照組集落形成率)×100%

1.2.6細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將加藥后的HepG2，培養(yǎng)48 h后，在倒置顯微鏡下放大200倍觀察細(xì)胞變化并拍照。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 鏡下觀察顯示，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)伸展,輪廓清晰,成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，加入5、10、20、30、40、50 μg/ml CUR的實(shí)驗(yàn)組，各濃度CUR組喜寶生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞體積縮小呈圓形，與周?chē)募?xì)胞脫離。見(jiàn)圖1。

2.2MTT法測(cè)定CUR對(duì)HepG-2的增殖抑制率 與空白對(duì)照組比較，各個(gè)濃度的CUR實(shí)驗(yàn)組對(duì)HepG2均有明顯的抑制作用(P<0.05)，并且，隨著CUR濃度的增大,對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用越明顯，表明CUR可以明顯抑制HepG2的增殖，達(dá)到控制癌細(xì)胞擴(kuò)散的作用。見(jiàn)表1。

A為空白對(duì)照組；B～G分別為加入5、10、20、30、40、50 μg/ml CUR實(shí)驗(yàn)組

2.3CUR抑制腫瘤細(xì)胞集落形成 不同濃度的CUR(5，10，50 μg/ml)的抑制率分別為0.550±0.183，0.201±0.086，0.058±0.011。試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的升高，給藥組的集落生長(zhǎng)速度較對(duì)照組慢，腫瘤細(xì)胞所形成的集落數(shù)目也逐漸減少，集落形成抑制率逐漸增加。見(jiàn)圖2。

表1 CUR對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用±s)

圖2 CUR作用的肝癌細(xì)胞HepG-2集落形成圖

3 討 論

姜黃是郁金屬姜科植物姜黃干燥根莖的主要成分,始載于《新修本草》,具行氣滯、散風(fēng)活血而止痛之功效,常用于利膽、消炎、抗菌等治療。CUR是姜黃的主要成分,也是咖喱、芥末中的主要黃色色素,屬于天然植物多酚類(lèi)抗氧化劑,由于其無(wú)毒，在亞洲許多國(guó)家被廣泛用于調(diào)料及食用色素。CUR抗腫瘤的作用由印度學(xué)者Kuttan等〔2〕在1985年首次提出，發(fā)現(xiàn)CUR可明顯抑制中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)和Dultoncs淋巴瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也初步證實(shí)CUR對(duì)小鼠艾氏腹水瘤生長(zhǎng)具有抑制作用。隨后CUR的抗腫瘤作用日益引起人們的重視，美國(guó)國(guó)立腫瘤所已將其列為第三代癌化學(xué)預(yù)防藥。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CUR對(duì)HepG2細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖抑制作用。為CUR用于體內(nèi)的抗腫瘤活性研究提供了科學(xué)依據(jù)。

4 參考文獻(xiàn)

1Kunnumakkara AB,Anand P,Aggarwal BB.Curcumin inhibits proliferation,invasion,angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins〔J〕.Cancer Lett,2008;269(2):199-225.

2Kuttan R,Bhanumathy P,Nirmala K,etal.Potential anticancer activity of turmeric(Curcuma longa)〔J〕.Cancer Lett,1985;29(2):197-202.