任建軍 孟興凱 牛劍祥

(內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院普通外科，內蒙古 呼和浩特 010059)

肝細胞癌的特點是具有豐富的血運，提示腫瘤血管生成在腫瘤的發(fā)展中起著至關重要的作用。臨床上一般采取手術、放化療等綜合療法，然而預后仍不理想〔1,2〕。microRNA-20a(miR-20a)是一種多功能的miRNA。研究發(fā)現(xiàn)，miR-20a能決定人間充質干細胞(MSCs)成骨分化的命運和調控成骨分化的過程。同時，miR-20a還是一種癌增殖調節(jié)子，可抑制多種腫瘤細胞的增殖、分化并促進腫瘤細胞的凋亡。Fan等〔3〕發(fā)現(xiàn)miR-20a表達下調可促進癌細胞增殖，并與HCC預后和生存率相關。本實驗擬觀察miR-20a對人肝癌細胞HepG2裸鼠皮下種植腫瘤生長情況以及裸鼠體重的影響，miR-20a對腫瘤組織中VEGFA表達的影響，以期明確miR-20a抑制腫瘤生長的機制。

1 材料與方法

1.1材料和試劑 BALB/c裸鼠(SPF級)購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；miR-20a片段，陰性片段及紅色熒光標記的轉染效率檢測對照購自Invitrogen公司；肝癌細胞系HepG2購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所；MEM-EBSS購自Gibco公司、胎牛血清購自Hyclone公司；免疫組化用VEGFA購自Santa Cruz公司；SP免疫組化試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 肝癌細胞系HepG2用含10%胎牛血清的MEM-EBSS培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。細胞長至80%融合進行傳代。

1.2.2轉染步驟及轉染效率的檢測 細胞轉染前以PBS洗2次，每個轉染條件的細胞用100 μl預先放置于室溫的Nucleofector?電轉液重懸(細胞以電轉液重懸后，后續(xù)所有操作必須在20 min 內完成)；每個樣本細胞懸液中加入300 pmol的相應RNA；將上述細胞懸液轉入電轉杯中(樣品必須覆蓋電轉杯杯底，且杯底部分不可有氣泡存在)，蓋上電轉杯蓋；選擇電轉程序，并將電轉杯放入電轉儀中，運行電轉程序；電轉程序結束立即取出電轉杯；使用試劑盒提供的移液管吸500 μl預熱的培養(yǎng)基入電轉杯中，并輕輕將細胞轉入12 孔板中，不可反復吹打細胞；細胞放入孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，6 h 后更換培養(yǎng)基；陽性對照可于轉染后8～12 h 用流式細胞儀檢測轉染效率。

1.2.3裸鼠接種 上述轉染細胞計數后以無血清MEM-EBSS培養(yǎng)基重懸，制備成1×108/ml的細胞懸液，30只裸鼠隨機分為3組，實驗組(HepG2-miR-20a組)、陰性對照組(HepG2-NC組)和空白對照組(HepG2組)，每組10只。皮下接種轉染miR-20a agomir的HepG2細胞、轉染陰性片段NC的HepG2細胞和不經任何處理的HepG2細胞，并每周2次，用0.2 ml的注射器將0.1 ml制備的細胞懸液注射于BALB/c裸鼠腋窩中部背側皮下，接種時嚴格無菌操作。種植腫瘤長至3～4 mm時，即認為荷瘤成功。

1.2.4腫瘤體積計算方法 腫瘤體積計算公式：V=(腫瘤最長徑)×(腫瘤最短徑)2/2。根據公式計算腫瘤體積并繪制生長曲線。接種35 d后處死裸鼠，取出腫瘤組織測腫瘤重量，并計算腫瘤生長抑制率：腫瘤生長抑制率=(1-處理組腫瘤重量/對照組腫瘤重量)×100%。

1.2.5免疫組化檢測VEGFA表達 組織塊固定常規(guī)石蠟切片脫蠟水化，其余步驟按試劑盒說明進行。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0 軟件行t檢驗或ANOVA檢驗。

2 結 果

2.1細胞轉染效率檢測 采用Lonza電轉法進行肝癌細胞HepG2的RNA轉染，轉染效率可高達90%以上。

2.2裸鼠成瘤及生長狀況 HepG2-miR-20a組腫瘤生長較其余兩組緩慢，第21天開始HepG2-miR-20a組腫瘤體積與其余兩組差異明顯。第35天時，HepG2-miR-20a組平均瘤質量為(1.16±0.12)g，明顯低于HepG2-NC組(2.66±0.45)g及HepG2組(2.77±0.44)g(P<0.01)。HepG2-miR-20a組與HepG2-NC組相比腫瘤生長抑制率為57%，與HepG2組相比腫瘤生長抑制率為58%。見圖2。

圖1 裸鼠移植瘤生長曲線

2.3裸鼠體重變化 第35天時，HepG2-miR-20a組腫瘤體積顯著低于HepG2-NC組和HepG2組(P<0.01)，且HepG2-miR-20a組裸鼠體重亦顯著高于HepG2-NC組和HepG2組(P<0.01)。

2.4免疫組化測定腫瘤組織中VEGFA表達 HepG2-miR-20a組VEGFA表達顯著低于HepG2-NC組和HepG2組。見圖3。

圖3 腫瘤組織中VEGFA表達

3 討 論

肝癌是世界上最常見的腫瘤之一〔4〕，78%的肝癌是由肝炎病毒感染引起的〔5〕。盡管通過手術切除、血管介入治療和肝移植等，現(xiàn)在一些肝癌早期可以治愈。然而伴有肝硬化的患者中只有30%適宜做這樣的治療〔6〕。

miRNA最早于1993 年由Lee 等〔7〕在線蟲體內發(fā)現(xiàn)，是一類約22 nt大小的非編碼單鏈RNA分子。每個miRNA可以調控多個靶基因，而每個基因的mRNA又可以受到多個miRNA的調節(jié)。越來越多的證據顯示了腫瘤中miRNA的差異表達，如慢性淋巴細胞性白血病中的miR-15a 和 miR-16-1、肺癌中的let-7等〔8，9〕。在肝細胞癌(HCC)中，多個miRNA異常表達已被證明參與了肝癌的惡性生物學行為〔10,11〕，更有學者認為其可以作為優(yōu)于基因的新的診斷和治療靶點。

miR-20a和miR-106a分別屬于miR-17-92家族和它的旁系miR-106a-363家族。目前有研究發(fā)現(xiàn)，miR-20a可以抑制E2F2和E2F3的表達〔12〕。miR-20a還具有抗凋亡的作用，過表達可減少前列腺癌細胞的凋亡。然而，miR-20a在肝癌中的作用目前尚未見報道。本研究通過裸鼠肝癌模型發(fā)現(xiàn)，HepG2-miR-20a組腫瘤生長較其余兩組緩慢，至實驗結束時，HepG2-miR-20a組裸鼠體重顯著高于陰性對照組和空白對照組，且HepG2-miR-20a組腫瘤體積顯著小于其他兩組，同時HepG2-miR-20a組VEGFA表達顯著低于HepG2-NC組和HepG2組。提示，miR-20a可能是通過抑制VEGFA表達，從而達到抑制肝癌細胞HepG2裸鼠皮下移植瘤的生長作用。

4 參考文獻

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4Parkin DM,Bray F,Ferlay J,etal. Global cancer statistics,2002.〔J〕. CA Cancer J Clin,2005;55:74-108.

5Perz JF,Armstrong GL,Farrington LA,etal. The contributions of hepatitis B virus and hepatitis C virus infections to cirrhosis and primary liver cancer worldwide〔J〕. J Hepatol,2006;45(4):529-38.

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7Lee RC,Feinbaum RL,Ambros V. The C. elegans hereochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisence complementarity to lin-14〔J〕. Cell,1993;75(5): 843-54.

8Calin GA,Sevignani C,Dumitru CD,etal. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers〔J〕. Proc Natl Acad Sci US A,2004;101:2999-3004.

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11Jiang J,Gusev Y,Aderca I,etal. Association of MicroRNA expression in hepatocellular carcinomas with hepatitis infection,cirrhosis,and patient survival〔J〕. Clin Cancer Res,2008;14: 419-27.

12Sylvestre Y,De GV,Querido E,etal. An E2F/miR220a autoregulatory feedback loop〔J〕. J Biol Chem,2007;282(4): 2135-43.