阮航，趙玉潔，吳丹紅，胡天惠

（廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院抗癌研究中心，福建廈門(mén)361102）

苦參堿對(duì)乙基硝基亞硝基胍誘導(dǎo)大鼠胃癌的化學(xué)預(yù)防作用

阮航，趙玉潔，吳丹紅，胡天惠Δ

（廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院抗癌研究中心，福建廈門(mén)361102）

目的探討苦參堿對(duì)乙基硝基亞硝基胍誘導(dǎo)大鼠胃癌的化學(xué)預(yù)防作用。方法選取雄性Wistar大鼠100只，隨機(jī)分成4組，分別飲用不同的藥物。其中陰性對(duì)照組(A組）25只，自由飲用純凈水；胃癌模型組(B組）25只，予以乙基硝基亞硝基胍(ENNG）1.5mg/(只·d）；實(shí)驗(yàn)組(C組）胃癌模型大鼠25只，予以注射用苦參堿150mg/(kg·d）和乙基硝基亞硝基胍1.5mg/(只· d）；對(duì)照組(D組）陰性大鼠25只，予注射用苦參堿150mg/(kg·d）。飼養(yǎng)24周后處死大鼠，肉眼和顯微鏡下觀察各組大鼠胃黏膜改變情況，并檢測(cè)胃組織增殖細(xì)胞核抗原(PCNA）、血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1）和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2）水平。結(jié)果B組大鼠胃黏膜癌變率64.00%(16/25）明顯高于C組胃黏膜癌變率12.00%(3/25），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）；C組大鼠PCNA、TGF-β1和Bcl-2水平明顯低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）；飼養(yǎng)24周后B組大鼠胃黏膜萎縮、異型增生等改變率明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）；飼養(yǎng)24周后，A、D 2組大鼠胃黏膜均未發(fā)生癌變，胃黏膜萎縮、異型增生等改變無(wú)明顯差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論苦參堿能夠通過(guò)降低PCNA、TGF-β1和Bcl-2水平抑制ENNG誘導(dǎo)大鼠胃癌發(fā)生，為苦參堿對(duì)人類(lèi)胃癌潛在的化學(xué)預(yù)防作用提供了理論基礎(chǔ)。

苦參堿；乙基硝基亞硝基胍；胃癌；化學(xué)預(yù)防作用

注射用苦參堿是從中藥苦參中提取的純中藥藥物，苦參堿、 氧化苦參堿、異苦參堿、槐果堿、異槐果堿等多種生物堿為其主要成分［1］?？鄥⒕哂星鍩嵩餄瘛⑾x(chóng)、利尿等功效［2］。研究表明［3］，苦參堿不僅具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫和抗病毒作用，還具有抗纖維化和抗腫瘤的作用。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)［4-6］，苦參堿能夠明顯抑制人肝癌細(xì)胞、宮頸癌Hela細(xì)胞、白血病癌細(xì)胞以及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株等機(jī)體癌細(xì)胞的生長(zhǎng)；能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡；降低癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力?？鄥A在抑制胃癌細(xì)胞方面的研究也較多，但缺乏對(duì)胃癌動(dòng)物模型的化學(xué)預(yù)防作用的報(bào)道［7］。為了明確苦參堿對(duì)胃癌的化學(xué)預(yù)防作用，筆者做了有關(guān)研究。通過(guò)觀察比較苦參堿對(duì)不同動(dòng)物模型胃黏膜的影響，來(lái)探究苦參堿對(duì)乙基硝基亞硝基胍誘導(dǎo)大鼠胃癌的化學(xué)預(yù)防作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對(duì)乙基硝基亞硝基胍（N-Ethyl-N'-nitro-N-nitroguanidine，1-Ethyl-3-nitro-1-nitrosogu，ENNG）購(gòu)于自瑞士Fluka公司；100只6周齡雄性Wistar大鼠（合格證號(hào)D20021024），平均體質(zhì)量（153±14）g，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海動(dòng)物中心，置于標(biāo)準(zhǔn)條件實(shí)驗(yàn)室里［室溫（24±2）℃；相對(duì)濕度（55± 5）%，每隔12 h進(jìn)行一次亮/暗循環(huán)］，定時(shí)定量用混合飼料喂養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》，符合 3R原則。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 60只大鼠隨機(jī)分成4組單籠喂養(yǎng)，正常飲食，分別飲用不同的藥物。其中陰性對(duì)照組（A組）25只，自由飲用純凈水；胃癌模型組（B組）25只，予以乙基硝基亞硝基胍（ENNG）1.5mg/（只·d）；實(shí)驗(yàn)組（C組）胃癌模型大鼠25只，予以注射用苦參堿150mg/（kg·d）和乙基硝基亞硝基胍1.5mg/（只·d）；對(duì)照組（D組）陰性大鼠25只，予注射用苦參堿150 mg/（kg·d），以上藥物均由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自行飲用。ENNG儲(chǔ)存液每周按照說(shuō)明書(shū)配置1次，將配置好的儲(chǔ)存液置于4℃避光環(huán)境中保存。每4周稱(chēng)取每組大鼠體質(zhì)量，記錄體質(zhì)量，并隨著體質(zhì)量改變更變藥物劑量。

1.3 檢測(cè)指標(biāo) 飼養(yǎng)24周后，予以全身麻醉后，剖腹取出胃后處死大鼠，從胃大彎開(kāi)始解剖胃，用肉眼觀察標(biāo)本大體變化，分組拍照并用10%甲醛固定，然后于病變明顯處各取一小塊組織（3mm×8mm），石蠟包埋，乙醇脫水后，于顯微鏡下進(jìn)行組織病理觀察。剩余胃組織儲(chǔ)存于-80℃中，檢測(cè)每毫升胃組織勻漿中PCNA、TGF-β1和Bcl-2蛋白水平，檢測(cè)方法為ELISA試劑盒（武漢博士德生物試劑有限公司）和蛋白定量法，并且嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)計(jì)量資料用“±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用率表示，用χ2檢驗(yàn)處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 飼養(yǎng)24周后4組大鼠胃黏膜改變比較 飼養(yǎng)24周后B組大鼠胃黏膜癌變率［64.00%（16/25）］明顯高于C組胃黏膜癌變率［12.00%（3/25）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B組大鼠胃黏膜萎縮、異型增生等改變率明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A、D 2組大鼠胃黏膜均未發(fā)生癌變，胃黏膜萎縮、異型增生等改變無(wú)明顯差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表1、圖1）。

表1 4組大鼠胃黏膜改變比較情況［n（%）］Tab.1 Comparison of gastric mucosa changes in four groups［n（%）］

圖1 顯微鏡大鼠胃黏膜病理切片F(xiàn)ig.1 Rat gastricmucosa pathological section

2.2 4組大鼠胃組織PCNA、TGF-β1和Bcl-2水平比較 飼養(yǎng)24周后C組大鼠胃組織PCNA、TGF-β1和Bcl-2水平明顯低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），A、D 2組大鼠胃組織PCNA、TGF-β1和Bcl-2水平無(wú)明顯差異（見(jiàn)表2）。

表2 4組大鼠胃組織PCNA、TGF-β1和Bcl-2水平比較情況（μg/m L）Tab.2 Comparison of gastric tissue PCNA，TGF-β1 and Bcl-2 levels（μg/mL）

3 討論

胃癌（gastric carcinoma）是由于胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖和凋亡之間失去動(dòng)態(tài)平衡，癌基因被激活，抑癌基因被抑制，胃上皮細(xì)胞過(guò)度增殖，又不能啟動(dòng)凋亡信號(hào)，而逐漸發(fā)展為胃癌［8］。胃癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)各種惡性腫瘤中居首位［9］。好發(fā)于中老年男性，5年生存率較低。本病早期臨床表現(xiàn)不典型，無(wú)明顯癥狀易被忽略，中晚期臨床表現(xiàn)為胃脘部疼痛，食欲減退，消瘦乏力，貧血，惡心嘔吐和排除黑便等［10］。本病大多與地域環(huán)境、生活飲食習(xí)慣、感染幽門(mén)螺桿菌、遺傳以及既往有胃疾病病史等因素有關(guān)［11］。本病預(yù)后不良，患者生活質(zhì)量較差，帶來(lái)很大痛苦。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，本病患者更加重視疾病防治及預(yù)后，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采取手術(shù)聯(lián)合放化療等療法。但是手術(shù)和放化療給患者帶來(lái)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，使患者生活質(zhì)量大幅度降低。因此要降低胃癌發(fā)病率，除了消除及避免接觸致癌物質(zhì)之外，還需要醫(yī)療界對(duì)胃癌高危人群或癌前病變患者進(jìn)行化學(xué)預(yù)防，在萌芽中殺死胃癌細(xì)胞。研究表明［12］，苦參堿能夠抑制肝癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞、白血病癌細(xì)胞等等癌細(xì)胞，并具有較好的化學(xué)性預(yù)防作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，飼養(yǎng)24周后A、D 2組大鼠胃黏膜均未發(fā)生癌變，胃黏膜萎縮、異型增生等改變無(wú)明顯差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明注射用苦參堿對(duì)陰性大鼠胃黏膜無(wú)明顯不良影響；B組大鼠胃黏膜癌變率64.00%明顯高于C組胃黏膜癌變率12.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明注射用苦參堿能夠明顯降低癌前病變大鼠的癌變率；C組大鼠胃組織PCNA、TGF-β1和Bcl-2水平明顯低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），證明苦參堿能夠通過(guò)降低大鼠胃組織PCNA、TGF-β1和Bcl-2表達(dá)，促使癌細(xì)胞凋亡；B組大鼠胃黏膜萎縮、異型增生等改變率明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），證明苦參堿能夠阻斷胃炎-腸化-非典型增生-癌變的演變過(guò)程［13］。研究表明苦參堿能夠把癌細(xì)胞分裂阻滯在G1期，無(wú)法進(jìn)入DNA合成，而抑制胃癌細(xì)胞的增殖［14］；能夠降低PCNA、TGF-β1和Bcl-2表達(dá)而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡［15］；通過(guò)抑制胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡來(lái)阻止癌組織新生血管形成［16］；能夠抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中必需酶的活性，來(lái)阻止胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［17］，這也于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中得到論證。

綜上所述，苦參堿具有明顯降低胃癌模型大鼠的癌變率的能力，降低胃組織中PCNA、TGF-β1和Bcl-2表達(dá)促使胃癌細(xì)胞凋亡。雖然本次實(shí)驗(yàn)是研究動(dòng)物模型，但是以單純的中藥提取物的抗腫瘤制劑對(duì)人類(lèi)胃腸道的副作用較小，相對(duì)較安全，是未來(lái)人類(lèi)抗胃癌和胃癌化學(xué)性預(yù)防的重要潛在性藥物。

［1］ 劉益均，鄭軍，肖文波，等.氧化苦參堿對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響［J］.中國(guó)癌癥雜志，2010(5）：22-26.

［2］張中良.觀察苦參堿聯(lián)合化療治療進(jìn)展期胃癌的療效［J］.中國(guó)社區(qū)醫(yī)師，2014(12）：86-87.

［3］ 向發(fā)良.苦參素對(duì)L02、HepG2細(xì)胞的增殖及對(duì)HepG2中MicroRNA-122、MicroRNA-21表達(dá)的影響［D］.桂林醫(yī)學(xué)院，2013.

［4］ 劉暢.苦參堿及聯(lián)合順鉑對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞中TSLC1基因表達(dá)的影響［D］.蘭州大學(xué)，2014.

［5］ 胡蘅芬.氧化苦參堿對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞HGC-1表達(dá)的影響及調(diào)控機(jī)制研究［D］.南華大學(xué)，2012.

［6］謝捗善.苦參堿誘導(dǎo)的自噬在原發(fā)性肝癌中的作用［D］.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2012.

［7］張軍強(qiáng).苦參堿誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬和凋亡的機(jī)制研究［D］.蘭州大學(xué)，2013.

［8］ 王俊霞，王超，呂品田.氧化苦參堿通過(guò)ERK途徑影響SGC7901胃癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制［J］.河北醫(yī)藥，2013(7）：10-12.

［9］董燕，李銀霞，嚴(yán)祥.苦參堿對(duì)慢性萎縮性胃炎模型大鼠胃黏膜的保護(hù)作用［J］.山東醫(yī)藥，2013(12）：28-30.

［10］陳立波.苦參堿對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖、凋亡及Survivin基因表達(dá)的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，15(5）：235-238.

［11］許進(jìn)秀，趙世葉，王愛(ài)蓉，等.復(fù)方苦參注射液聯(lián)合FOLFOX方案治療晚期胃癌的臨床觀察［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013(9）：1812-1815.

［12］王雷，劉明.苦參堿對(duì)大腸癌細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2表達(dá)的影響［J］.中國(guó)腫瘤，2012(7）：237-240.

［13］覃紅斌，張潔，張京偉.復(fù)方苦參注射液聯(lián)合FOLFOX4化療方案治療晚期胃癌的作用［J］.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版），2012(10）：215-218.

［14］ 郭旭輝，張娜，李林森.苦參堿對(duì)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，10(2）：2500-2501.

［15］ 王俊霞，王超，呂品田.苦參堿和氧化苦參堿對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC7901/VCR耐藥性的作用［J］.河北醫(yī)藥，2012，23(05）：3537-3539.

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［17］ 劉粉霞，徐玉芳，孫寧.氧化苦參堿誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，31(6）：27-28，32.

（編校：吳茜，秦曉英）

Chem ical preventive effect ofmatrine on ethyl nitrate nitroguanidine nitrate induced gastric cancer in rats

RUAN Hang，ZHAO Yu-jie，WU Dan-hong，HU Tian-huiΔ

（Cancer Research Center，Medical College of Xiamen University，Xiamen 361102，China）

ObjectiveTo investigate the chemical preventive effectofmatrine on ethylnitrate nitroguanidine nitrate induced gastric cancer in rats.Methods100 male Wistar rats were selected and random ly divided into four groups，each had 25 rats，treated with different drugs respectively.Rats in the negative control group（group A）freely drunk water；each rat in gastric carcermodel group（group B）drunk ethyl nitrate nitroguanidine nitrate（ENNG）1.5 mg/d by themselves；gastric cancer model rats of experimental group（group C）drunk matrine 150 mg/（kg·d）ethyl nitrate nitroguanidine nitrate（ENNG）150mg/（kg·d）by themselves；negative control group（group D）rats drunk matrine for injection 150 mg/（kg·d）by themselves.Rats were killed after 24 weeks，ratswere observed on gastricmucosa change by naked eye and microscope，and detected proliferating cell nucleus antigen（PCNA）of stomach tissue，levels of serum transforming growth factorβ1（TGF-β1）and B cell lymphoma/leukemia-2（Bcl-2）.ResultsCanceration rate［64.00%（16/25）］of the rat gastric mucosa in Group B was significantly higher than that in group C［12.00%（3/25）］，and the difference was statistically significant（P＜0.05）；PCNA，TGF-β1and the Bcl-2 level of rats in group C was lower than those in group B，and the difference was statistically significant（P＜0.05）；after raising 24 weeks，change rate of gastric mucosa atrophy and hyperplasia in group B were significantly higher than those of group C，and the difference was statistically significant（P＜0.05）；after raising 24 weeks，there was no cancerous changes on gastric mucosa in group A and D，and the change of gastric mucosa atrophy and hyperplasia had no obvious difference，there was no statistically significant difference.ConclusionMatrine could inhibit rat gastric cancer induced by ENNG by lowering PCNA，TGF-β1and the Bcl-2 levels，which provides evidence for the potential chemical preventive effect on human gastric cancer.

matrine；ethyl nitrate nitroguanidine nitrate；gastric cancer；chemical prevention effect

R735.2

A

1005-1678(2014）07-0052-03

國(guó)家自然科學(xué)基金（81172284），廈門(mén)市重大科技項(xiàng)目（3502Z20100006）

阮航，女，博士，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向：腫瘤藥理學(xué)，E-mail：yeprhang@126.com；胡天惠，男，博士，教授，研究方向：腫瘤分子生物學(xué)，通信作者，E-mail：thu@xmu.edu.cn。