胡若愚，承燕，李好，張雷，景華，吳海衛(wèi)

(南京大學(xué)臨床學(xué)院,南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 心胸外科，江蘇 南京 210002)

急性肺損傷(acute lung injury， ALI)與急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome， ARDS)廣泛存在于各種嚴(yán)重臨床疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中[1]。目前認(rèn)為，在ALI的發(fā)病初期，肺組織損傷的主要病理表現(xiàn)是肺血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。由于肺泡-毛細(xì)血管所構(gòu)成的氣血屏障受破壞，導(dǎo)致肺血管通透性的增加，使得大量組織液攜帶各種炎癥細(xì)胞及炎癥因子進(jìn)入肺間質(zhì)及肺泡中，并隨之引發(fā)肺水腫；肺水腫又進(jìn)一步加重了氧氣彌散障礙并增加死腔通氣量，從而導(dǎo)致了組織缺氧,并引起機(jī)體進(jìn)一步的損傷[2- 3]。自1967年Ashbaugh等首次提出ARDS的概念后，醫(yī)學(xué)工作者嘗試使用了各種藥物治療該疾病，然而治療效果仍不盡如人意[4]。

自Asahara等[5]首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)外源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)以來(lái)，不斷有研究揭示了EPC作為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞在血管新生及內(nèi)皮修復(fù)中所發(fā)揮的重要作用。EPC多存在于骨髓中，并可被多種細(xì)胞因子、藥物、缺血及損傷信號(hào)動(dòng)員進(jìn)入血液循環(huán)，參與受損組織的內(nèi)皮修復(fù)及血管新生[6]。研究表明：EPC在治療肢體缺血、心肌缺血、腎臟疾病及移植血管成活等方面均有重要而獨(dú)到的作用[7- 11]。研究顯示：EPC作為一種機(jī)體自身修復(fù)途徑，通過(guò)遷移、黏附于血管受損部位，替代受損內(nèi)皮細(xì)胞或通過(guò)其旁分泌作用產(chǎn)生新的細(xì)胞因子而促進(jìn)內(nèi)皮再生，在維持機(jī)體血管內(nèi)皮修復(fù)及更新過(guò)程中發(fā)揮重要作用。不僅如此，EPC在ALI的治療中也顯示其獨(dú)特的作用。Burnham等研究了ALI患者預(yù)后與循環(huán)血中EPC數(shù)量之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ALI/ARDS患者循環(huán)中的EPC數(shù)量增加，EPC數(shù)量高的患者預(yù)后好；同時(shí)，外周血EPC的數(shù)量可以反映炎癥相關(guān)性肺損傷血管損傷的程度，并可作為評(píng)價(jià)疾病預(yù)后的指標(biāo)之一[12]。根據(jù)上述研究結(jié)果，我們推測(cè)：外周血循環(huán)中的EPC數(shù)量決定了肺血管損傷后肺血管內(nèi)皮的修復(fù)的速度及水平，并直接影響疾病的進(jìn)展和預(yù)后。然而，由于生理狀態(tài)下，外周血循環(huán)中EPC含量極低，僅占外周血單核細(xì)胞總量的0.002%[13]，因此，進(jìn)行EPC移植治療是迅速提高外周血循環(huán)中EPC水平直接而有效的途徑。

本研究中，我們以轉(zhuǎn)基因EGFP- BALB/c小鼠作為細(xì)胞供體，自骨髓單核細(xì)胞分離、培養(yǎng)獲得EGFP- EPC，并在體外大量擴(kuò)增后，回輸至由內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的野生型BALB/c小鼠ALI模型體內(nèi)。試圖通過(guò)外源性EPC移植治療加速ALI小鼠肺血管損傷修復(fù)進(jìn)程，改善其預(yù)后。同時(shí)應(yīng)用熒光顯微鏡觀察輸入的外源性EGFP- EPCs在受體鼠體內(nèi)遷移及歸巢情況,并通過(guò)組織病理學(xué)檢查、肺組織濕干重比、肺組織微血管再生情況等檢測(cè)手段，綜合評(píng)價(jià)外源性EPC移植對(duì)ALI的治療效果，為臨床使用EPC治療ALI提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及主要儀器

野生型BALB/c小鼠18只，雄性， 5～7周齡，體重21～25 g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供，恒溫、清潔環(huán)境飼養(yǎng)，不限食水。轉(zhuǎn)基因EGFP- BALB/c小鼠30只，雄性，5～7周齡，體重18～23 g，與所用的野生型BALB/c小鼠屬同一祖系，平行傳代，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供，恒溫、清潔環(huán)境飼養(yǎng)，不限食水。LPS(Escherichia coli O55:B5，美國(guó)Sigma- Aldrich公司)，人纖維連接蛋白(美國(guó)R&D公司)，小鼠淋巴細(xì)胞分離液(美國(guó)Sigma- Aldrich公司)，大鼠抗小鼠CD34單克隆抗體(ab815，英國(guó)Abcam公司)，羊抗大鼠IgG- FITC抗體(sc- 2011，美國(guó)Santa Cruz公司)，超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán))，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olympus IX71型)。

1.2 小鼠骨髓源性EPC的分離與培養(yǎng)

每次取雄性BALB/c小鼠6只，麻醉并處死后于75%酒精中浸泡30 min。于超凈工作臺(tái)上將小鼠雙下肢股骨、脛骨分離并取出，以1 ml注射器吸取PBS沖洗小鼠脛、股骨骨髓腔，密度梯度離心法獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以5×106·孔-1細(xì)胞量將細(xì)胞接種于人纖維連接蛋白包被的6孔培養(yǎng)板中，每孔內(nèi)加EGM- 2 Single Qutos培養(yǎng)液2 ml。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞接種后第4天首次更換細(xì)胞培養(yǎng)液，棄去未貼壁細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。此后每2 d更換培養(yǎng)液1次。細(xì)胞培養(yǎng)3周，每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，并拍照留存。

1.3 ALI小鼠模型制作及分組

野生型BALB/c小鼠行戊巴比妥腹腔注射麻醉，頸部脫毛并以75%酒精消毒術(shù)野。于小鼠頸部正中行長(zhǎng)約0.5 cm切口。鈍性分離小鼠頸部肌肉，暴露氣管。以1 ml注射器吸取預(yù)先配制好的LPS溶液50 μl，經(jīng)小鼠氣管內(nèi)滴注。滴注時(shí)，抬高操作臺(tái)成45°角，使LPS溶液順氣管流入小鼠肺部。滴注后，將小鼠直立并旋轉(zhuǎn)，使LPS在肺內(nèi)盡量均勻分布。其后以絲線縫合小鼠頸部切口。受體BALB/c雄性小鼠共18只，隨機(jī)分為3組，每組6只。分別為：假手術(shù)組 (經(jīng)氣管內(nèi)滴注50 μl PBS，其后30 min經(jīng)尾靜脈注射100 μl PBS)、ALI組(經(jīng)氣管內(nèi)滴注5 mg·kg-1LPS，體積為50μl，30 min后經(jīng)尾靜脈注射100 μl PBS)、EPC治療組(經(jīng)氣管內(nèi)滴注5 mg·kg-1LPS，體積為50 μl，30 min后根據(jù)受體小鼠體重經(jīng)尾靜脈注射EGFP- EPCs細(xì)胞懸液，注射細(xì)胞量為5×104·g-1)。各組小鼠均飼養(yǎng)至術(shù)后3 d處死，留取肺組織標(biāo)本。

1.4 移植受體小鼠肺組織中外源性EPC的表達(dá)

迅速打開處死后BALB/c小鼠的胸腔，摘取左上肺,以O(shè)CT包埋小鼠肺組織，置于冰凍切片機(jī)中-18 ℃速凍后行5 μm切片，并迅速于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 移植受體小鼠肺損傷程度評(píng)估

1.5.1 肺組織病理切片觀察及肺損傷評(píng)分 BALB/c小鼠處死后，迅速摘取其左下肺組織，中性福爾馬林固定，石蠟包埋、脫水后切片，行蘇木素- 伊紅染色，中性樹脂封片后于顯微鏡下觀察并拍攝照片。將各組小鼠肺組織HE切片與光學(xué)顯微鏡下觀察并行雙盲評(píng)分。評(píng)分指標(biāo)包括肺泡組織結(jié)構(gòu)、肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)出血情況、肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況、肺泡內(nèi)透明膜形成程度。4項(xiàng)指標(biāo)以0～4分進(jìn)行半定量分析，累積評(píng)分為該切片肺損傷指數(shù)評(píng)分。

1.5.2 肺組織濕干重終比測(cè)定 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及動(dòng)物模型制作方法同前。預(yù)先留取的小鼠右側(cè)肺組織，以微量天平稱量小鼠右肺質(zhì)量。此后將肺組織放入烘箱內(nèi)50 ℃烘焙24 h取出。再次稱量小鼠肺干重。小鼠肺部濕干重比計(jì)算方法為：濕干重比=(肺濕重-肺干重)/肺干重×100%。

1.5.3 移植受體小鼠肺組織新生微血管密度(MVD)測(cè)定 以CD34為新生血管標(biāo)記物。將移植受體小鼠肺組織行石蠟切片后進(jìn)行CD34免疫組化染色，細(xì)胞棕褐色染色為CD34表達(dá)陽(yáng)性。各組BALB/c小鼠中，每組隨機(jī)選取4個(gè)樣本，每只小鼠對(duì)應(yīng)免疫組化染色切片選取2張。先于低倍鏡下選取CD34表達(dá)陽(yáng)性率最高部位作為檢測(cè)部位,然后光鏡400倍選取該區(qū)域5個(gè)視野拍攝。統(tǒng)計(jì)每張照片1 mm2區(qū)域中CD34陽(yáng)性染色的微血管數(shù)量，其平均值為該組小鼠肺組織切片所對(duì)應(yīng)的MVD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 EGFP- EPCs的培養(yǎng)

EGFP- EPCs分離、培養(yǎng)方法與自野生型BALB/c小鼠骨髓單核細(xì)胞分離、培養(yǎng)EPCs方法完全相同。在培養(yǎng)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)，所培養(yǎng)的EGFP- EPCs生長(zhǎng)、增殖能力與普通EPCs相同，細(xì)胞早期呈集落樣生長(zhǎng)狀態(tài)(圖1A)，細(xì)胞培養(yǎng)至3周后，細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)鋪路石樣狀態(tài)(圖1B)。

圖1EGFP-EPCs熒光顯微鏡下照片A.早期EGFP- EPC呈集落樣生長(zhǎng)狀態(tài);B.晚期EGFP- EPCs于熒光顯微鏡下呈現(xiàn)“鋪路石”樣生長(zhǎng)

Fig1EGFP-EPCsobservedunderfluorescentmicros-copeA.Early EGFP- EPCs exhibited a colony- forming appearance;B.Late EGFP- EPCs exhibited a cobblestone- like appearance

2.2 肺組織冰凍切片觀察細(xì)胞移植受體小鼠肺組織中外源性輸入EGFP- EPC

熒光顯微鏡下觀察各組受體小鼠肺組織冰凍切片中輸入的EGFP- EPCs熒光表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)接受外源性EGFP- EPCs治療的熒光小鼠組肺組織冰凍切片內(nèi)肺血管內(nèi)壁上附著有明顯的綠色熒光層(圖2A)。而假手術(shù)組(圖2B)及ALI組(圖2C)中則無(wú)法觀測(cè)到明顯的綠色熒光表達(dá)。該結(jié)果提示：外源性輸入的EGFP- EPCs可隨血液循環(huán)定向遷移至受損肺血管內(nèi)皮部位，與之黏附從而發(fā)揮內(nèi)皮治療作用。

2.3 各組小鼠肺組織HE切片檢查及各組肺損傷評(píng)分結(jié)果

HE切片顯示：假手術(shù)組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、出血及透明膜形成征象(圖3A)。LPS可致嚴(yán)重的肺組織損傷，表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)的破壞、肺泡腔減小、肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)出血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡透明膜形成等(圖3B)。EPC治療組的肺組織病理切片較之ALI對(duì)照組損傷程度明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)基本維持，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肺組織充血程度也有明顯降低(圖3C)。肺損傷指數(shù)評(píng)分顯示：LPS誘導(dǎo)的ALI明顯增加了肺組織損傷指數(shù)評(píng)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(10.83±1.17vs1.17±0.98，P<0.001)，EPC治療組肺損傷程度顯著降低(7.67±1.21vs10.83±1.17，P=0.003)，但較假手術(shù)組仍明顯增高(7.67±1.21vs1.17±0.98，P<0.001)(圖4)。

圖2EPC治療組(A)、假手術(shù)組(B)、ALI組(C)肺組織冰凍切片于熒光顯微鏡下照片箭頭所指為肺血管內(nèi)膜上明顯的綠色熒光信號(hào)，提示移植的EGFP- EPC細(xì)胞可定向黏附于受損的肺血管內(nèi)膜表面

Fig2LungtissuefrozensectionsfromEPCgroup(A),shamgroup(B),ALIgroup(C)

圖3各組小鼠肺組織HE染色切片A.假手術(shù)組;B.ALI組;C.EPC組

Fig3HEstainingoflungtissuesA.Sham group;B.ALI group;C.EPC treatment group

圖4肺損傷指數(shù)評(píng)分與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與ALI組比較，bP<0.01

Fig4DeterminationoflunginjuryscoresCompared with the sham group， aP<0.01; compared with ALI group，bP<0.01

2.4 各組小鼠肺濕干重比測(cè)定

肺濕干重比ALI組較假手術(shù)組明顯增高 [(72.17±5.98)%vs(23.00±3.74)%，P<0.001]。而EPC治療組較ALI組明顯降低(61.67±6.25%vs72.17±5.98%，P<0.05)，但仍明顯高于假手術(shù)組 (61.67±6.25%vs23.00±3.74%，P<0.001)(圖5)。

圖5肺組織濕干重比測(cè)定與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與ALI組比較，bP<0.01

Fig5DeterminationoflungwettodryratioCompared with the sham group,aP<0.01;compared with ALI group，bP<0.01

2.5 移植受體小鼠肺組織MVD測(cè)定

假手術(shù)組與ALI組比較，新生血管的MVD值極低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而EPC治療組新生血管密度明顯增加，與其他兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖6)。

圖6CD34免疫組化染色肺MVD測(cè)定與假手術(shù)組比較, aP<0.01；與ALI組比較，bP<0.01

Fig6DeterminationofCD34immunostainingMVDCompared with the sham group，aP<0.01;compared with ALI group，bP<0.01

3 討 論

肺血管內(nèi)皮損傷是ALI/ARDS發(fā)病的始動(dòng)因素[14]，如能在ALI發(fā)病早期對(duì)受損的肺血管內(nèi)皮進(jìn)行快速而有效的修復(fù)，則可以從源頭上阻止疾病的進(jìn)一步發(fā)展,從而提高治愈率。隨著對(duì)ALI/ARDS研究的不斷深入以及干細(xì)胞治療技術(shù)的興起，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，EPC細(xì)胞治療作為一種全新的治療方法，可能是ALI/ARDS治療的新思路[15- 16]。EPC主要存在于人體骨髓中，在損傷、缺氧、細(xì)胞因子以及藥物等作用因素的動(dòng)員下進(jìn)入血液循環(huán)，并有著向受損器官及組織定向遷移的特性。研究表明，EPC不僅能夠以“嵌合”的方式直接參加受損血管部位內(nèi)皮損傷修復(fù)，替代壞死或凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞，還能夠發(fā)揮旁分泌作用，促進(jìn)內(nèi)皮損傷的修復(fù)和血管的新生[17- 19]。而更有研究表明，體內(nèi)EPC的水平與ALI/ARDS的病程進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。Burnham與Yamada均研究了外周血中EPC水平及集落形成能力與患者ALI/ARDS預(yù)后的相關(guān)性，并得出了一致的結(jié)論。他們的研究認(rèn)為：ARDS發(fā)生時(shí)，如果內(nèi)體內(nèi)EPC水平過(guò)低或活力低下，往往預(yù)后不佳。因此，EPC 已成為反映ALI血管損傷程度的指標(biāo)之一，同時(shí)也是對(duì)炎癥預(yù)后判斷的重要預(yù)警指標(biāo)[20- 22]。對(duì)于上述現(xiàn)象，Denburg等[23]提出，炎癥反應(yīng)時(shí)釋放的炎癥介質(zhì)及多種未知因素動(dòng)員骨髓的EPC 進(jìn)入外周循環(huán)感知損傷，并通過(guò)動(dòng)員和遷移到達(dá)受損部位，修復(fù)血管內(nèi)皮，形成新生血管，恢復(fù)局部血流，促進(jìn)組織結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)。然而，在生理狀態(tài)下EPC的水平極低，一旦機(jī)體遭受重大打擊，體內(nèi)的EPC往往不能及時(shí)滿足機(jī)體血管損傷修復(fù)的需要。因此，EPC移植作為利用EPC治療疾病的有效手段，被人們逐漸認(rèn)識(shí)和重視。

近幾年，已有學(xué)者開始嘗試通過(guò)自體EPC體外擴(kuò)增后回輸至ALI動(dòng)物模型體內(nèi)進(jìn)行ALI/ARDS治療，并已取得明顯的治療效果[24- 25]。但從臨床實(shí)用角度考慮，自體細(xì)胞回輸往往不符合臨床實(shí)際工作需要：由于ALI/ARDS發(fā)病的突然性，患者很少有機(jī)會(huì)預(yù)留干細(xì)胞以備臨床治療之需。而EPC抗原性相對(duì)較弱，機(jī)體排斥反應(yīng)較輕，因此，同種異體EPC移植可能是更為有效并切合臨床實(shí)際工作需要的治療方法。與此同時(shí)，人們發(fā)現(xiàn)EPC至少存在2種細(xì)胞亞型：早期EPC和晚期EPC。在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、成血管能力等方面，晚期EPC均明顯優(yōu)于早期EPC。因此，晚期EPC被認(rèn)為具有更加廣泛和美好的治療前景[26]。然而，由于對(duì)晚期EPC的研究和報(bào)道相對(duì)較晚，目前尚未見(jiàn)有明確使用晚期EPC治療ALI/ARDS的研究報(bào)道。本研究使用培養(yǎng)超過(guò)3周的晚期EPC作為移植細(xì)胞治療ALI/ARDS，在細(xì)胞體外擴(kuò)增、培養(yǎng)的過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)方式呈現(xiàn)典型的“鋪路石”樣生長(zhǎng)排列，且細(xì)胞增殖速度較早期EPC明顯加快，符合晚期EPC的生長(zhǎng)特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：使用這種晚期EPC進(jìn)行細(xì)胞移植治療，能夠明顯改善LPS所誘導(dǎo)的肺組織損傷，維持肺血管內(nèi)皮的完整性，減少肺泡結(jié)構(gòu)的破壞以及炎癥因子向肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)的聚集。

為了有效地對(duì)輸入體內(nèi)的外源性內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞示蹤，我們選用了轉(zhuǎn)基因EGFP- BALB/c小鼠作為細(xì)胞供體。該種型小鼠基因中含有EGFP基因，其有核細(xì)胞均表達(dá)EGFP蛋白，于熒光顯微鏡下發(fā)出耀眼的綠色熒光，信號(hào)強(qiáng)度高且穩(wěn)定，并可完全避免細(xì)胞標(biāo)記過(guò)程中對(duì)細(xì)胞活性的損傷。此外，由于EGFP基因在EGFP- EPC中穩(wěn)定表達(dá)，不受細(xì)胞增殖及分化的影響，因此，能夠更全面、客觀地反映出外源性細(xì)胞在體內(nèi)的增殖及分化情況。我們的研究表明：外源性輸入的EGFP- EPCs能夠在肺血管內(nèi)大量定植，并黏附于血管壁內(nèi)膜上，反映出輸入體內(nèi)的外源性EPC向受損組織及器官趨化的特性。CD34免疫組化染色多用于反映組織內(nèi)新生血管的情況。在本研究中，通過(guò)使用CD34抗體標(biāo)記的肺組織切片觀察，并統(tǒng)計(jì)單位面積內(nèi)陽(yáng)性標(biāo)記的微血管數(shù)量，我們發(fā)現(xiàn)：無(wú)論是假手術(shù)組還是ALI組，其肺組織上CD34的表達(dá)均極低，而進(jìn)行細(xì)胞移植的受體鼠肺組織切片上，可看到明顯的陽(yáng)性標(biāo)記，差異顯著。該現(xiàn)象從側(cè)面提示我們：在機(jī)體遭受重大打擊時(shí)，自身骨髓的EPC動(dòng)員是非常有限的，往往不能夠滿足急性打擊下機(jī)體自身修復(fù)的需要，因此更凸顯出外源性EPC移植在ALI/ARDS這種突發(fā)打擊下迅速提高血循環(huán)內(nèi)EPC水平、滿足機(jī)體修復(fù)需要的重要而獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述,使用外源性EPC移植治療ALI/ARDS，能夠有效地修復(fù)受損肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，維持肺泡- 毛細(xì)血管氣血屏障的完整性，減少炎癥細(xì)胞及炎癥因子向肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)浸潤(rùn)，從而加速受損肺組織內(nèi)的內(nèi)皮修復(fù)及血管新生，并最終減輕肺損傷。

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