王江博，李延清，慧 恒，孫志宏

(延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000)

近年來，環(huán)境雌性激素效應(yīng)日益引起學(xué)術(shù)界的關(guān)注，大量調(diào)查資料表明環(huán)境中能模擬雌激素作用的化學(xué)物質(zhì)較多，人們將這一大類具有雌激素樣作用的化學(xué)物稱為環(huán)境激素(environmental esrogens,EEs)。它們能影響生物機(jī)體的分泌、轉(zhuǎn)動(dòng)、結(jié)合、排泄、生理作用等，從而影響生死系統(tǒng)發(fā)育，破壞內(nèi)分泌系統(tǒng)平衡，從而導(dǎo)致腫瘤。環(huán)境雌激素是人類及動(dòng)物的重要研究方向之一[1]。

目前，屬于環(huán)境雌激素的化學(xué)物質(zhì)較多，雙酚A(bisphenol A,BPA)就是其中的一種，它是酚類化合物中具有代表性的環(huán)境污染物。BPA化學(xué)名稱為二酚基丙烷，分子式C15H16O2，水中溶解度為1000 mg/L，毒性偏低，易溶于醇、醚、丙酮、脂類等有機(jī)溶劑[2]。BPA被廣泛地用于生產(chǎn)各種碳酸聚酯類塑料，如碳酸聚脂、環(huán)氧樹脂及殺菌劑等，并不斷開發(fā)新用途。隨著塑料制品及環(huán)氧樹脂的廣泛應(yīng)用，BPA的污染物在環(huán)境中的排放量逐漸增加，它們?cè)诃h(huán)境中降解釋放出BPA，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，從而對(duì)人類和動(dòng)物造成一定的影響。由于BPA的效應(yīng)已經(jīng)引起人們的關(guān)注，所以對(duì)BPA的研究已有了初步的進(jìn)展，主要體現(xiàn)在，(1)生殖毒性，BPA具有內(nèi)分泌干擾物作用，對(duì)雄性生殖系統(tǒng)有一定的損害；(2)胚胎發(fā)育毒性和致畸性；(3)致癌作用[3]。目前BPA對(duì)人和小鼠影響的研究較多，但對(duì)具有獨(dú)特生活習(xí)慣兩棲類動(dòng)物研究較少，所以我們通過對(duì)花背蟾蜍腹腔注射不同濃度的BPA對(duì)其血清蛋白所產(chǎn)生的影響進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

游標(biāo)卡尺，中國(guó)上海；電子天秤 MP200A，上海精科天平；離心機(jī) KDC-40，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；電泳儀 DYY-Ⅲ1型穩(wěn)壓，北京六一儀器廠；電泳槽 DYYⅢ型，北京六一儀器廠；乙酸纖維素薄膜 規(guī)格28 cm，路橋四甲生化塑料廠；紫外可見分光光度計(jì) 752 N：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑藥品

花生油：魯花壓榨一級(jí)花生油山東魯花集團(tuán)有限公司；BPA：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；巴比妥：西安化學(xué)試劑廠；巴比妥鈉：西安化學(xué)試劑廠；氨基黑10B：中國(guó)上海標(biāo)本模型廠；甲醇：西安化學(xué)試劑廠；乙醇：西安化學(xué)試劑廠；冰醋酸：天津市百世化工有限公司；檸檬酸三鈉：西安化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH8.6離子強(qiáng)度0.07)配制方法[3]：巴比妥2.76 g；巴比妥鈉15.45 g，加水至1000 ml；染色液：氨基黑10B0.25 g，甲醇50 ml，冰醋酸10 ml，蒸餾水40 ml；漂洗液 甲醇或乙醇45 ml，冰醋酸5 ml，蒸餾水50 ml，透明液 無水乙醇75 ml，冰醋酸25 ml，血液抗凝劑3.8 g檸檬醋三鈉，加蒸餾水至100 ml，BPA溶液：取BPA溶解于花生油分別配成濃度為50 μmol/kg，100 μmol/kg，150 μmol/kg 的BPA溶液NaOH溶液：0.4 mol/l。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取16只花背蟾蜍，體重85±5 g，分成四組，對(duì)照組(注射花生油)，低劑量組(50 μmol/l)，中劑量組(100 μmol/l)，高劑量組(150 μmol/l)，注射不同劑量的BPA溶液1 ml，注射6 d，第7 d集中解剖。

1.4 取樣

固定花背蟾蜍，剪開胸腔，心臟取血(每只蟾蜍約可抽取1 ml鮮血)，以4∶1加入檸檬酸三鈉溶注入離心管內(nèi)，立即離心，(3000 R/min，3 min)離心后，取血清備用。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

參照醋酸纖維薄膜電泳法[4]。用氨基黑10B染色液染色10 min，然后用漂洗液漂洗3次，每次5 min，即可在薄膜上出現(xiàn)清晰的譜帶.選取譜帶多而清晰的薄膜量取膜上各條帶的泳動(dòng)距離，然后放在清水中進(jìn)行照相。拍照后，對(duì)入選膜進(jìn)行定量測(cè)定，即將薄膜上的各個(gè)蛋白帶剪下，分別放入9支試管中，同時(shí)在相應(yīng)膜上剪下大小相同的無蛋白區(qū)的薄膜放入第10支試管中作為空白對(duì)照。然后向各管加入NaOH溶液(0.4 mol/L) 4 mL，在37℃條件下水浴30 min后浸泡12 h，在722型分光光度計(jì)620 nm處比色，記錄A620 nm值。根據(jù)各蛋白區(qū)帶的A620值計(jì)算其相對(duì)含量。各種蛋白質(zhì)的相對(duì)含量等于其A620 nm值占蟾蜍血清蛋白A620 nm總值的百分比。泳動(dòng)度按U=dL/Vt公式計(jì)算，式中d為電泳圖譜中各條帶的泳動(dòng)距離，L為支持物的有效長(zhǎng)度，V為110 V，t為7200 s[5]。

2 結(jié)果

2.1 蟾蜍的形態(tài)學(xué)的觀察

飼養(yǎng)花背蟾蜍的過程中，注射花生油對(duì)照組的生長(zhǎng)情況良好，給實(shí)驗(yàn)組注射不同劑量的BPA，出現(xiàn)行動(dòng)遲緩，精神低靡，隨著BPA劑量的增大，這種情況越來越明顯，與對(duì)照組形成明顯對(duì)比。在解剖花背蟾蜍過程中，發(fā)現(xiàn)花背蟾蜍體內(nèi)有少量油花，實(shí)驗(yàn)組的中、高劑量組體內(nèi)有腹水。實(shí)驗(yàn)組隨著BPA劑量的增加，對(duì)中、高劑量組心臟上造成不同程度的損傷，心包膜上小點(diǎn)越來越明顯，粘稠性增加，心跳加快，但搏動(dòng)無力。

2.2 花背蟾蜍血清電泳圖譜

結(jié)果表明，花背蟾蜍的血清蛋白經(jīng)過醋酸纖維薄膜電泳，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組中的低劑量組可分離出9條蛋白條帶，也就是說明該血清中有9種蛋白質(zhì)，這9種蛋白質(zhì)的分類及編號(hào)參照蟾蜍血清中各種蛋白質(zhì)泳動(dòng)度的名稱編號(hào)[6]。對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組中的低劑量組中，清蛋白區(qū)有4種，球蛋白區(qū)有5種，兩區(qū)之間有明顯的蛋白空白區(qū)，這9種蛋白從正極開始依次為：α1-清蛋白、α2清蛋白、β1-清蛋白、β2-清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白、δ-球蛋白、ε-球蛋白[7]。實(shí)驗(yàn)組中：中、高劑量組電泳條帶中有8條蛋白條帶，缺少γ-球蛋白條帶。測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中的低、中、高劑量組蟾蜍各血清蛋白質(zhì)的OD值時(shí)，發(fā)現(xiàn)各蛋白的含量有顯著的差異(圖1)。對(duì)照組和低、中、高劑量組的酸纖維薄膜電泳圖譜(表1)，花背蟾蜍血清中各種蛋白的遷移率見表2，各種蛋白質(zhì)含量的差異顯著(表3)。

圖1 蟾蜍血清電泳條帶中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

表1 蟾蜍血清的電泳圖譜

表2 花背蟾蜍血清中的部分蛋白的遷移率

表3 花背蟾蜍血清中各種蛋白質(zhì)的含量

注釋：這是在紫外可見分光光度計(jì)752 N在D620 nm處的OD值。

3 討論

BPA是一種環(huán)境雌激素，也是一種低毒性物質(zhì)，能影響生物機(jī)體的分泌、轉(zhuǎn)動(dòng)、結(jié)合、排泄、生理作用等，破壞內(nèi)分泌系統(tǒng)平衡，從而影響生物的生存、發(fā)育[8]。對(duì)照組中：注射花生油，花生油是一種脂肪，部分花生油能被蟾蜍臟器吸收，為花背蟾蜍提供物質(zhì)能量來源，所以對(duì)照組的花背蟾蜍生長(zhǎng)狀態(tài)良好。實(shí)驗(yàn)組中：注射了BPA，對(duì)花背蟾蜍機(jī)體造成一定的影響，如肝、心臟、肺、腎等有顯著影響，這就使實(shí)驗(yàn)組的花背蟾蜍機(jī)體的分泌、轉(zhuǎn)動(dòng)、結(jié)合、排泄、生理作用等產(chǎn)生了一定影響，這種影響隨著注射BPA劑量的增大而越明顯，心臟搏動(dòng)加快、行動(dòng)遲緩、精神低靡。

動(dòng)物血清中含有多種蛋白質(zhì)，不同種類的蛋白質(zhì)，有其獨(dú)特的一級(jí)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，在pH值相同的同一種緩沖溶液的電場(chǎng)中，它們的帶電性質(zhì)和帶電量不同，各種蛋白質(zhì)的構(gòu)象不同，等電點(diǎn)也有所不同(一般小于7.0)，通過電泳將血清中不同種類的蛋白分離[9]。如果動(dòng)物血清中的蛋白受到一定的影響，如構(gòu)象、帶電性質(zhì)、帶電量、等電點(diǎn)發(fā)生了改變，也就是蛋白發(fā)生了一定程度的變性，失去生物活性，這樣電泳技術(shù)就很難把變性的血清蛋白分離出來[10]。

實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組中，沒有注射BPA，血清蛋白沒有受到影響，所以能把血清中的9種蛋白分離出來。在實(shí)驗(yàn)中的低劑量組中，由于BPA注射劑量較小，對(duì)蟾蜍血清蛋白的影響不明顯。而在中、高劑量組中，γ-球蛋白沒有被分離出來，與對(duì)照組相比少了一條蛋白條帶，這可能與BPA在機(jī)體中的運(yùn)輸方式有關(guān)[11]。BPA是一種環(huán)境雌激素， 在進(jìn)入機(jī)體后與細(xì)胞內(nèi)雌激素受體結(jié)合，通過多種機(jī)制產(chǎn)生擬雌激素或抗雌激素作用，從而干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能[12-13]。據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)：γ-球蛋白可能是BPA在花背蟾蜍體內(nèi)的受體。BPA對(duì)這個(gè)受體—γ-球蛋白有毒性作用，且隨注射劑量的增大，影響越明顯。使γ-球蛋白變性，失去生物活性，導(dǎo)致電泳技術(shù)無法分離出來[14]。

蟾蜍血清的電泳時(shí)間，電流強(qiáng)度，電壓大小，點(diǎn)樣筆等，在眾多資料中還有很大的差異，但是點(diǎn)樣還是電泳技術(shù)的關(guān)鍵[15]。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王佳,詹平.雙酚A對(duì)機(jī)體影響及其機(jī)制的研究進(jìn)展[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)志,2005,21(5): 541-543.

[2]龍冬梅,張浩,程薇波,等.圍生期BPA暴露對(duì)雄鼠子一代生長(zhǎng)和腦發(fā)育形態(tài)的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006,37(4): 570-573.

[3]劉基芳,劉乾,倪亞杰,等.BPA對(duì)雄性小鼠生殖細(xì)胞凋亡[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2006,22(5): 572-573.

[4]王秀奇，秦淑媛，高天慧，等.基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)(第2版)[M].北京：高等教育出版社,1999,142-145.

[5]李延清,劉長(zhǎng)海,徐世才,等.花背蟾蜍血清蛋白成分的電泳分析[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,27(13): 1244.

[6]何士敏,王鑫.東北蟾蜍血清蛋白質(zhì)成分初步分析[J].生物技術(shù),2 000,10(2): 43-45.

[7]劉建強(qiáng),孟青妹.青海蟾蜍血清蛋白質(zhì)成分的電泳分析[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,2003,33(10): 64-65.

[8]張玉敏,崔金山,段志文,等.環(huán)境雌激素BPA對(duì)小鼠生精功能的影響[8].工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病,2004,30(5): 296-298.

[9]趙穎怡,汪嶸,韋宇拓,等.人血清白蛋白的研究進(jìn)展[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué),2002,21(2): 126-128.

[10]林勇,張浩,王文東,等.圍生期BPA暴露對(duì)雄性子代大鼠中腦巴胺神經(jīng)細(xì)胞亡的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006,37(4): 570-573.

[11]Mohammad A,Awal,Masamichi Kurohmaru,et al.Effect of Bisphenol A on the Sertoli Cell Culture from Prepu-bertal Male Wistar Rats[J].Asian Network for Scientific In-formation,2002,2(1): 19-23.

[12]Hardin BD,Bond GP,Sikon MR,et al.Testing of select workplace chemicals for teratogenic potential [J].Scand J WorkEnviron Health,1981,7(4): 66-75.

[13]Susan CN,Frederick S,Kristina A,et al.Relative binding affinity-serum modified access (RBA-SMA) assay predicts the relative in vivo bioactivity of the xenoestrogens bisphenol A and octylphenol [J].Environ Health Perspect,1997,105: 70-76.

[14]Blot H M,Petra Janning,Horst Michna,et al.Comparative assessment of endocrine modulators with oestrogenic activity: Definition of a hygiene-based margin of safeth (HB-MOS) for xeno-oesreogens against the background of European developments[J].Arch Toxicol,2001,74: 649-662.

[15]Andrew AT.Electrophoresis: theory,techniques,and biochemical and clinical applications [M].Oxford:Clarendon Press,1986,pp1-4.