王朝陽 楊化冰 黃少祥

(湖北中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，湖北 武漢 430065)

金香丹有行氣活血，化淤止痛，擴張冠狀動脈，增加冠狀動脈血流量的功效，對心肌缺血再灌注損傷有較好的保護作用〔1〕。研究證實心肌缺血再灌注損傷與細胞凋亡關系密切，本研究旨在探討金香丹對大鼠缺血再灌注心肌細胞凋亡的影響及其保護機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級雄性SD大鼠80只，體重(200±20)g，購自湖北省醫(yī)學科學院動物實驗中心。

1.2試劑及藥品 細胞凋亡測試盒(TUNEL法)購自南京建成生物工程研究所；Bax、Bcl-2、Caspase-3即用型SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒，均購自武漢博士德生物工程有限公司；金香丹片由湖北省荊州市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供(批號9912061)；地奧心血康膠囊由成都地奧制藥有限公司生產(批號9912061)。

1.3分組及給藥 80只SD大鼠采用數(shù)字表法隨機分4組：假手術組、模型組、金香丹組和地奧心血康組，每組20只。假手術組大鼠每天生理鹽水灌胃2 ml，共7 d，末次灌胃1 h后行假手術；模型組大鼠灌胃(方法同上)后行結扎左冠脈30 min，再灌注60 min；金香丹組、地奧心血康組大鼠每天分別予金香丹片1.08 g/kg、地奧心血康膠囊54 mg/kg溶于2 ml生理鹽水中灌胃，共7 d。

1.4模型建立 大鼠末次灌胃后12 h，以20%烏拉坦(1 g/kg) 腹腔注射麻醉,按文獻方法〔2〕建立動物模型，將大鼠背位固定于鼠板上，監(jiān)測肢體Ⅱ導聯(lián)心電圖。分離氣管并插管，即行微型人工呼吸機正壓呼吸(頻率54次/min，流量2 ml/100 g)。于胸骨左側0.5 cm處用手術刀從第3～5肋骨縱行切開1cm切口，分開肌層，剪斷第4肋骨，剪開心包，暴露心臟，用左手壓迫右側胸腔及腹部將心臟擠出胸腔外，以左冠狀動脈主干為標志，于左心耳根部下2 mm處進針，以0號無損傷絲線穿過心肌淺層在肺動脈圓錐旁出針，立即將一根直徑2 mm的硅膠管置于血管與結扎線之間， 除假手術組左冠脈前降支下只穿線不結扎外，其他組均結扎左冠脈前降支。以結扎后心電圖S-T段抬高明顯為結扎成功標準，立即將心臟送回原位并關閉胸腔。結扎30 min后剪斷結扎線，S-T段陡然下降1/2以上，標志再灌注成功，再灌注60 min后經大鼠腹主動脈取血，即刻斷頸處死大鼠，完整摘取心臟。

1.5標本采集 實驗結束前自大鼠左室活體灌注含肝素的生理鹽水后，再灌注4%多聚甲醛以預固定心臟，取出心臟標本后繼續(xù)固定24 h(40℃)。常規(guī)石蠟包埋，于心肌梗死區(qū)中部沿左室軸線每隔1 mm連續(xù)切取數(shù)張5 μm厚的切片，分別作心肌細胞凋亡及Bax，Bcl-2及Caspase-3蛋白表達檢測。

1.6觀測指標

1.6.1心肌細胞凋亡測定 按TUNEL試劑盒說明書檢測心肌細胞凋亡。鏡下凋亡陽性細胞其細胞核為棕色，正常細胞其細胞核為藍色。凋亡指數(shù)(AI)：AI(%)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。每張在400倍鏡下隨機選擇5個視野，分別計數(shù)各組在每個視野內AI，最終結果取平均值。

1.6.2心肌組織Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達測定 按免疫組化檢測試劑盒說明進行操作，細胞質染成棕色棕褐色為蛋白陽性表達。在400倍鏡下采集標本圖像，用LEICAQWINICI像分析儀進行圖像分析，每張樣品隨機選取并采集6～10個視野，分析Bax、Bcl-2及 Caspsase-3蛋白陽性染色指數(shù)(PI)。PI(%)=陽性細胞數(shù)/視野中所有細胞總數(shù)×100。

1.7統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

各組心肌細胞AI及Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達比較，見表1。與假手術組比較，模型組心肌細胞AI、Bax及Caspase-3的蛋白表達明顯升高(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達下降(P<0.01)；與模型組比較，金香丹組及地奧心血康組心肌細胞AI及Bax，Caspase-3的蛋白表達降低(P<0.01)，Bcl-2的蛋白表達上升(P<0.01)，金香丹組與地奧心血康組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 各組心肌細胞AI及Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達比較

3 討 論

研究表明〔3〕，缺血缺氧不僅能導致心肌細胞壞死，也可以誘導心肌細胞凋亡。細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的病理特征之一，且與再灌注性心律失常、心肌重構、心肌頓抑以及心力衰竭等病理機制密切相關。細胞凋亡是一種受基因調控的主動性細胞死亡，表現(xiàn)為凋亡信號通路的啟動和相關基因的表達。Bcl-2家族是目前最主要的凋亡調控基因，通過線粒體途徑，調控細胞凋亡〔4〕。Bcl-2基因家族包括兩大類，Bcl-2是一種凋亡抑制基因,而Bax是一種促凋亡基因，兩者間相互作用調控細胞凋亡〔5〕。Caspases蛋白家族是Ca2+依賴性的半胱氨酸蛋白酶,參與細胞凋亡啟動、執(zhí)行過程的調節(jié)，效應性Caspase的活化被認為是細胞凋亡進入不可逆階段的標志。有研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注后缺血區(qū)心肌細胞Bcl-2表達下降，而Bax表達增多，細胞凋亡的發(fā)生不僅與凋亡促進基因的表達密切相關，而且依賴于凋亡抑制基因表達產物與凋亡促進基因表達產物之間的比值〔6〕。在眾多Caspase成員中，Caspase-3被認為是各種凋亡刺激因子激活的Caspase家族中的關鍵蛋白酶，其可引起DNA損傷修復酶降解，同時激活核酸內切酶，從而使細胞凋亡。Caspsase-3介導的凋亡參與了心肌缺血再灌注損傷形成，且Caspsase-3激活是心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞凋亡導致心功能下降的機制之一〔7〕。因此，抑制心肌細胞凋亡是臨床上有效防治心肌缺血再灌注損傷的一條重要途徑。

本研究結果顯示，模型組較假手術組心肌細胞的AI明顯增加，Bcl-2蛋白顯著低表達，而Bax蛋白顯著高表達，說明細胞凋亡參與了心肌缺血再灌注損傷；金香丹組較模型組心肌細胞AI明顯降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高，而Bax、Caspase-3蛋白表達顯著下降，表明金香丹可以抑制缺血再灌注心肌細胞的凋亡，其作用可能與上調Bcl -2蛋白的表達并同時下調Bax、Caspase-3蛋白的表達有關。

4 參考文獻

1王朝陽，李 軍.金香丹對大鼠心肌缺血再灌注損傷保護作用及機制研究〔J〕.中國中醫(yī)急癥,2011；20(3):421-2.

2徐叔云,卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學〔M〕.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:45.

3Abbate A，Biondizoccai GG，Bussani R,etal.Increased myocardial apoptosis in patients with unfavorable left ventricular remodeling and early symptomatic post infarction heart failure〔J〕.J Am Coll Cardiol，2003；41(5):753-60.

4Mattson MP，Kroemer G.Mitochondria in cell death：novel targets for neuroprotection and cardioprotection〔J〕.Trends Mol Med，2003；9(5):196-205.

5張彥清，劉保江，田首元.丙泊酚對大鼠離體缺血/再灌注心肌細胞凋亡和Bcl-2 /Bax蛋白表達的影響〔J〕.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2011；9(1):55-7.

6Jayanthi S，Deng X，Bordelon M,etal.Methamphetamine causes differential regulation of pro-death and anti-death Bcl-2 genes in the mouse neocortex〔J〕.FASEB J,2001,15(10):1745-52.

7徐 強，司良毅，張 紅.大鼠心肌再灌注不同時相Caspase-3激活與心功能變化的關系〔J〕.第三軍醫(yī)大學學報，2005；27(23):2338-40.