孫玉華 許予明 賀維亞

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

血管性癡呆(VD) 是因腦血管病理因素影響腦組織血液循環(huán)，造成腦組織功能減退的認知功能缺損綜合征，在我國較常見，老年患者高發(fā)，疾病發(fā)展呈慢性進行性加重過程。海馬是腦組織的重要功能區(qū)，海馬對空間學習、記憶功能具有重要作用，慢性缺血、長期腦組織低灌注可損傷海馬區(qū)神經(jīng)元，是VD造成學習能力、記憶功能逐漸喪失的病理基礎(chǔ)〔1〕。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF) 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的一種蛋白質(zhì)，在腦神經(jīng)元細胞廣泛分布，BDNF對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，分化，生長具有重要作用，可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生指標〔2，3〕。有學者研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激是引起缺血后腦損傷的重要機制之一，與腦組織氧化還原平衡失調(diào)，激活過多的活性氧物質(zhì)，使缺血性損傷加重等因素有關(guān)〔4〕。 本研究通過建立VD大鼠模型，觀察VD大鼠的學習記憶能力、海馬神經(jīng)元細胞形態(tài)學變化及BDNF的表達水平，分析鹽酸美金剛干預(yù)VD的效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物分組 選取12～14月齡的健康雄性Wistar大鼠為研究對象，體重約為300～400 g，所有大鼠均購自河南省動物實驗中心。將飼養(yǎng)3 d后無明顯異常的60只大鼠隨機分為模型組、對照組、觀察組，每組各20只。

1.2模型的建立 模型組、觀察組均采用持久雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎方法制作VD大鼠模型。術(shù)前禁水4 h，禁食12 h，10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉劑量控制在3 ml/kg，避免麻醉過深。動物實驗臺固定模型組、觀察組大鼠，頸前部去毛、消毒，取頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，分別以雙重絲線結(jié)扎，然后逐層管壁切口，術(shù)中維持大鼠肛溫為36.5℃～37.5℃，術(shù)后送動物房飼養(yǎng)。對照組麻醉方法及手術(shù)過程同上，但不結(jié)扎頸總動脈。

1.3研究方法 術(shù)后8 w觀察組給予鹽酸美金剛干預(yù)，連續(xù)4 w。干預(yù)4 w結(jié)束后進行水迷宮實驗。將直徑1.2 m、高20 cm，水溫(23±0.5)℃的水迷宮裝置分成4個象限，第1象限放置直徑12 cm，高24 cm的透明平臺，以正西方向的標記點為起始，手提大鼠尾部自起始點放入水迷宮，訓練并強化大鼠游上平臺后休息的記憶，記錄3組大鼠找到平臺的平均時間。完成水迷宮測試后將大鼠斷頭取腦，在冰盒上剝離大鼠海馬組織，取1/2海馬組織制作為10%勻漿，離心后取上清液，按試劑盒要求分別采用硫代巴比妥酸、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒測定SOD、丙二醛(MDA)活性，并測定SOD、MDA的光密度(OD)值。剩余海馬組織置于4%多聚甲醛中浸泡24 h，HE染色和免疫組化技術(shù)嚴格按照試劑盒說明，步驟包括乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟后作連續(xù)冠狀切片，厚度約5 μm，采用SP免疫組化法檢測BDNF，免疫組化試劑盒均由北京中杉金橋生物技術(shù)公司提供，經(jīng)HE染色后在生物光學顯微鏡下觀察，采用 HPIAS-1000 病理圖像分析軟件分析圖像評價各組大鼠海馬區(qū)BDNF平均灰度值。比較3組大鼠腦皮質(zhì)MDA、SOD，BDNF表達水平的差異，分析鹽酸美金剛的干預(yù)效果。

2 結(jié) 果

2.13組大鼠水迷宮試驗結(jié)果分析 對照組水迷宮測試時間為(92.8±37.6)s，模型組為(154.6±38.7)s；與對照組比較，模型組水迷宮測試時間顯著延長(P<0.05)。觀察組測試時間為(117.4±34.2)s，與模型組比較顯著降低(P<0.05)。

2.23組大鼠海馬區(qū)組織形態(tài)學觀察 對照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細胞均勻、整齊，排列緊密，形態(tài)正常，胞核呈圓形或橢圓形，核仁明顯。模型組海馬區(qū)神經(jīng)元細胞數(shù)量降低，排列無規(guī)則，細胞核深染，核仁消失，胞質(zhì)周圍有空泡；觀察組海馬區(qū)形態(tài)學變化介于對照組與模型組之間，正常神經(jīng)元數(shù)量較對照組降低，但較模型組密集，排列規(guī)則，大部分胞核為圓形，核仁清晰；小部分細胞核仁消失，染色質(zhì)減少。

2.33組大鼠海馬區(qū)BDNF平均灰度值以及MDA、SOD光密度值的比較 對照組可見小部分陽性神經(jīng)元呈棕黃色顆粒染色，BDNF為弱強度表達。模型組神經(jīng)元細胞數(shù)量較少，但殘余神經(jīng)元胞核、胞質(zhì)均有棕黃色染色，BDNF呈強陽性表達；觀察組棕黃色染色神經(jīng)元數(shù)量較模型組增加，BDNF表達為中等強度。經(jīng)病理圖像分析軟件分析以及SOD、MAO的光密度(OD)值測定，3組大鼠海馬區(qū)BDNF平均灰度值以及MDA、SOD表達水平有顯著差異(P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠海馬區(qū)BDNF平均灰度值以及MDA、SOD光密度值的比較

3 討 論

BDNF具有內(nèi)源性自我保護作用，既往研究發(fā)現(xiàn)短暫性或持續(xù)性腦組織缺血均可刺激內(nèi)源性 BDNF 表達上升，促進受損神經(jīng)元細胞修復(fù)，加速受損傷神經(jīng)元細胞的分化及再生過程，并抑制細胞死亡〔5〕。本次研究中模型組大鼠海馬區(qū)BDNF表達水平高于對照組，提示長期缺血性損傷可引起海馬區(qū)神經(jīng)元細胞上調(diào)BDNF表達水平，與其他學者動物實驗研究相符〔6〕。另外，我們發(fā)現(xiàn)模型組MDA、SOD光密度值與對照組和觀察組具有顯著差異，提示氧化應(yīng)激反應(yīng)也是VD引起神經(jīng)元損傷的重要原因。MDA為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，是氧自由基的重要介質(zhì)，可作為評價衰老的重要指標；SOD是體內(nèi)氧自由基清除酶，MDA、SOD與機體氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)，可直接反映組織的氧化還原狀態(tài)，MDA、SOD水平可反映自由基損傷程度〔7〕。動物實驗發(fā)現(xiàn)在急性缺血期會出現(xiàn)MDA水平上升、谷胱甘肽(GSH)活性下降等改變〔8〕。本次研究結(jié)果提示VD大鼠海馬區(qū)存在持續(xù)的自由基損傷，過量的氧自由基攻擊神經(jīng)元細胞，并產(chǎn)生不可逆的神經(jīng)元細胞壞死，自由基損傷可能是慢性腦缺血海馬損傷的重要機制，但VD引起的長期氧化損傷的原因尚不清楚，尚需進一步研究。

鹽酸美金剛是一種新型的非競爭性 NMDA受體拮抗劑，具有低中度親和力以及電壓依賴性特性，是美國、歐洲首先批準治療中、重度阿爾茨海默綜合征的藥物，臨床使用安全性較高〔9,10〕。本研究證實模型組大鼠空間、記憶功能降低與海馬區(qū)結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)，鹽酸美金剛干預(yù)后可降低海馬區(qū)神經(jīng)元細胞壞死數(shù)量和程度，保護其空間記憶功能，與其他學者研究相符〔11〕。鹽酸美金剛可提高SOD水平，同時降低MDA活性，在清除海馬區(qū)氧自由基，減輕組織損傷方面具有一定的效果，我們認為美金剛對VD大鼠記憶功能具有保護作用，該作用機制與抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)，還可上調(diào)海馬區(qū)BDNF的表達水平，保護神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)和數(shù)量。

4 參考文獻

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