張 華 樊 霞 張明華

(武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,天津 300162)

前列腺癌是發(fā)生于老年男性常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤之一，高達(dá)95%的病例發(fā)病年齡在60～80歲。它的早期癥狀不明顯，病因研究不清楚，病人的預(yù)后根據(jù)發(fā)病的癥狀而不同。近年的研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展與微小RNA(miRNA)關(guān)系密切〔1〕。miRNA是一類長度為22個(gè)核苷酸，內(nèi)源性的非編碼單鏈小RNA分子，通過與靶基因3'UTR上的結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA的降解或者翻譯抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控著基因表達(dá)〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)miRNA調(diào)控著60%編碼蛋白的基因表達(dá)〔3〕，廣泛參與各種生物學(xué)過程〔4〕。本研究擬探討miR-92對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1材料 人前列腺癌細(xì)胞系PC-3和DU-145由本實(shí)驗(yàn)室保存，32個(gè)前列腺癌和26個(gè)良性前列腺增生組織由武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科提供，均經(jīng)過病理學(xué)鑒定。DMEM培養(yǎng)基和Opti-MEM無血清培養(yǎng)基均由Gibco公司提供，10%胎牛血清由Sigma公司提供，轉(zhuǎn)染用的脂質(zhì)體LipofectamineTM2000由美國的Invitrogen公司提供，miR-92的反義寡核苷酸和對(duì)照核苷酸由上海吉瑪公司提供，實(shí)時(shí)定量PCR的試劑由美國的Applied Biosystems提供，細(xì)胞增殖檢測試劑盒由 廣州市銳博生物科技有限公司提供，熒光素探針(Annexin V-FITC/EGFP)凋亡檢測試劑盒由美國羅氏公司提供。

1.2方法

1.2.1總RNA的提取 利用QIAGEN公司的RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取，然后檢測OD260和OD280的吸光度值，進(jìn)行RNA質(zhì)量和濃度的測定。

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA 取0.5 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，加入特異的miR-92的逆轉(zhuǎn)錄引物和焦碳酸二乙酯(DEPC)水，總體積13 μl，25℃反應(yīng)5 min，冰置2 min后，加入5×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑1 μl，總體積20 μl，42℃反應(yīng)1 h，70℃反應(yīng)10 min，得到cDNA產(chǎn)物，同時(shí)以U6作為內(nèi)源性對(duì)照。

1.2.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測miR-92的水平 取cDNA模板1 μl，miR-92的特異性前向引物1 μl，通用的反向引物1 μl，2×SYBR Green Master Mix 10 μl，添加無菌蒸餾水至20 μl總體積，按照以下反應(yīng)程序進(jìn)行：95℃ 5 min，之后是40個(gè)循環(huán)(95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s)，同時(shí)以U6作為對(duì)照。

1.2.4噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測細(xì)胞的活性 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前接種到48孔培養(yǎng)板，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。待第2天細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-92的反義寡核苷酸和對(duì)照。轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞接種到96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，分別在轉(zhuǎn)染后48、72、96 h加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后吸掉上清加入DMSO溶解10 min，最后用酶標(biāo)儀讀取在570 nm處吸光值(A570 nm)。

1.2.5EdU細(xì)胞增殖法檢測細(xì)胞的增殖情況 細(xì)胞轉(zhuǎn)染如上述過程，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后48 h加入EdU，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后進(jìn)行細(xì)胞的固定和染色，按照EdU細(xì)胞增殖試劑盒的說明進(jìn)行，最后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的增殖情況，統(tǒng)計(jì)EdU陽性的細(xì)胞數(shù)。

1.2.6Annexin-V/PI雙重染色法檢測細(xì)胞的凋亡情況 48 h后收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，按照Annexin-V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒的說明進(jìn)行，收集的細(xì)胞中加入100 μl 1 × Binding 緩沖液重懸，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI 染料,輕輕混勻，避光、室溫反應(yīng)10 min。加入400 μl 1× Binding緩沖液，輕輕混勻。樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。根據(jù)染色結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)生早期凋亡的細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1組織中miR-92的表達(dá)水平 與良性前列腺增生組織相比，miR-92在前列腺癌中的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖1。

2.2轉(zhuǎn)染anti-miR-92后細(xì)胞中miR-92表達(dá)水平 與轉(zhuǎn)染對(duì)照寡核苷酸組(設(shè)為1)相比，轉(zhuǎn)染anti-miR-92的細(xì)胞中miR-92的表達(dá)水平(PC-3細(xì)胞：0.17±0.021，DU-145細(xì)胞：0.19±0.023)降低(P<0.01)。

2.3MTT比色法檢測anti-miR-92對(duì)細(xì)胞活性的影響 與對(duì)照組相比，anti-miR-92能夠顯著抑制兩種細(xì)胞的活性，且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖1 前列腺癌和良性前列腺增生組織中miR-92表達(dá)

表1 anti-miR-92對(duì)PC-3、DU-145細(xì)胞活性的影響

2.4EdU細(xì)胞增殖法檢測anti-miR-92對(duì)細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組細(xì)胞相比，anti-miR-92導(dǎo)致EdU陽性的細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞增殖受抑制，在兩種細(xì)胞中產(chǎn)生類似的結(jié)果，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 anti-miR-92對(duì)PC-3和DU-145細(xì)胞增殖的影響

2.5Annexin-V/PI雙重染色法檢測anti-miR-92對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照比相比，轉(zhuǎn)染anti-miR-92后細(xì)胞的凋亡增加(P<0.05)。見表3。

表3 anti-miR-92對(duì)PC-3和DU-145細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

miRNA在腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮著基因調(diào)控因子的作用，它的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生密不可分〔5〕。為闡明miRNA在腫瘤中發(fā)揮的作用以及分子機(jī)制，首先需要得到差異性表達(dá)的miRNAs。一般通過miRNA表達(dá)譜分析和芯片技術(shù)初步得到在腫瘤中差異性表達(dá)的miRNA。De Preter等〔6〕在神經(jīng)母細(xì)胞瘤病人中進(jìn)行miRNA表達(dá)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-92在前列腺癌中高表達(dá)，并且與不良的預(yù)后關(guān)系密切。此外，對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤進(jìn)行藥物治療后，導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤中具有癌基因活性的miR-92表達(dá)降低〔7〕。這些研究表明miR-92在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，但是關(guān)于它在前列腺癌中的具體作用至今研究甚少，在本研究中，證實(shí)了miR-92在前列腺癌中表達(dá)升高，與以前的研究結(jié)果相似。

細(xì)胞的增殖和凋亡是影響腫瘤生長的重要因素，本研究結(jié)果表明miR-92可能發(fā)揮著癌基因的活性。miR-92是miR-17-92族的成員，這一家族在細(xì)胞的增殖中發(fā)揮著重要的作用。在骨髓瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-92促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖〔8〕。在結(jié)腸癌中，miR-92也扮演著癌基因的角色〔9〕。

miRNA是通過作用于它的靶基因而發(fā)揮作用，利用生物信息學(xué)預(yù)測了miR-92的候選靶基因是PTEN和BCL2L11。先前的研究證實(shí)在肝癌中PTEN與miR-92的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)〔10〕。在膠質(zhì)瘤中BCL2L11受miR-92負(fù)調(diào)控，是miR-92的靶基因〔11〕。而PTEN〔12〕和BCL2L11分別在肝癌和膠質(zhì)瘤中扮演著抑癌基因的角色，抑制腫瘤細(xì)胞的生長。這些作用與miR-92的作用相關(guān)，因此，我們推測在前列腺癌中PTEN和BCL2L11是miR-92的直接靶基因，介導(dǎo)miR-92作用的發(fā)揮，但是還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。同時(shí)，這些研究也說明了一種miRNA可能同時(shí)調(diào)控靶基因，參與一系列生物學(xué)過程的發(fā)生。而miRNA與多種靶基因之間的靶定關(guān)系可能和miRNA與靶基因3'UTR上的結(jié)合位點(diǎn)的不完全互補(bǔ)有關(guān)。

總之，本文中發(fā)現(xiàn)miR-92在前列腺癌中高表達(dá)并且促進(jìn)了前列腺癌細(xì)胞的生長,抑制了前列腺癌細(xì)胞的凋亡。 通過預(yù)測PTEN和BCL2L11為miR-92的潛在靶基因。這一結(jié)果為尋找前列腺癌的致病提供了新的分子機(jī)制，并且為探索治療前列腺癌新的分子標(biāo)志物提供了新策略。

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