高志影 張 春 董海影 劉得水 李公啟 張靜艷 孫玉榮 柏青楊 王紹清 張曉杰

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 151100)

“抑郁癥海馬神經(jīng)元再生障礙假說”的提出是近年來抑郁癥病因?qū)W研究最具突破性的進展之一，該假說認為抑郁癥的發(fā)生與神經(jīng)系統(tǒng)可塑性失調(diào)密切相關，表現(xiàn)為神經(jīng)損傷與神經(jīng)發(fā)生障礙〔1〕。因此，激活海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)前體細胞、促進成年腦神經(jīng)元再生可能為抑郁癥的治療帶來突破性的變革。環(huán)磷酸腺苷反應原件結(jié)合蛋白(CREB)作為核內(nèi)第三信使之一，在神經(jīng)發(fā)生及神經(jīng)可塑性形成中發(fā)揮重要作用，CREB介導的轉(zhuǎn)錄變化與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病關系密切，如認知功能減退、抑郁和腦缺血等〔2,3〕，鑒于其在神經(jīng)元功能和結(jié)構(gòu)可塑性調(diào)節(jié)中的重要作用，CREB也是抗抑郁治療的重要靶點之一〔4〕。石菖蒲在我國被用于治療腦部疾病，抗抑郁作用具有很好的臨床基礎〔5,6〕，而其主要有效成分β-細辛醚極易透過血腦屏障進入大腦。本研究進一步深入探討β-細辛醚促進抑郁大鼠海馬神經(jīng)重塑的關鍵環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 4～5月齡清潔級SD雄性大鼠60只，體重200～220 g，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證編號：SCXK(遼)2008-0002。

1.1.2藥品 β-細辛醚由齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)藥科學研究所分離提??；鹽酸氟西汀 (蘇州俞氏藥業(yè)有限公司，100201)。

1.1.3試劑與儀器 AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(美國BIPE公司)；SP免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程科技公司)。FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)，EM208S透射電子顯微鏡(荷蘭菲利浦公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組 動物適應性喂養(yǎng)1 w，通過敞箱實驗剔除不足30次或超過120次的大鼠，隨機分為正常對照組、模型組、西藥對照組和中藥組共四組，每組15只。

1.2.2造模方法 模型組、西藥對照組和中藥組單籠飼養(yǎng)，同時進行21 d的慢性輕度不可預見性應激刺激：電擊足底(電流強度1 mA，電壓45 mV，持續(xù)時間10 s/次，共30次)、搖晃(1次/s,15 min)、冰水游泳(4℃,5 min)、熱應激(45℃,5 min)、夾尾(3 min)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、束縛(8 h)、晝夜顛倒、傾斜鼠籠與潮濕墊料(100 g墊料中加入200 ml水)。

1.2.3給藥方法 造模同時，中藥組按25 mg·kg-1·d-1灌胃給予β-細辛醚，1次/d，連續(xù)21 d。西藥對照組按1.2 mg·kg-1·d-1灌胃給予氟西汀，1次/d，共21 d。

1.2.4抑郁模型大鼠行為學評價 Open-field測定方法：實驗裝置為高40 cm、底邊長80 cm、周壁涂黑、底板白色的無蓋方箱，底板用黑線劃成16 cm×16 cm的25個方格。以大鼠穿越底面格數(shù)為水平活動得分，大鼠3只腳以上均在同一格子內(nèi)為一格，穿越一格計1分，如大鼠沿線行走，以每10 cm為1分；以大鼠直立次數(shù)為垂直活動得分，雙足離開底面為標志。

糖水偏愛度的測定：24 h禁食禁水后，測定1 h動物飲用1%蔗糖水和純水的量，應用公式：1%蔗糖水消耗量/(1%蔗糖水消耗量+純水消耗量)×100%，計算各組大鼠糖水偏愛度值。

1.2.5免疫組化法檢測大鼠海馬區(qū)CREB蛋白的表達 大鼠灌注固定，斷頭取腦，分離海馬，固定，包埋，切片，加抗體，顯色，復染，脫水，封片，光鏡下觀察并用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)計算積分光密度。

1.2.6RT-PCR檢測大鼠海馬區(qū)CREB mRNA的表達 分離海馬，提取RNA，檢測RNA純度及完整性。使用Sequence Detection software version 1.2.3軟件分析各標本的循環(huán)閾值(Ct 值)。采用ΔCt法計算實驗結(jié)果，以2-ΔCt為 mRNA 的相對濃度，實驗組與對照組 mRNA 相對濃度的比值為實驗組mRNA表達相對于對照組的倍數(shù)。CREB 引物：前向5′-ACAGATTGCCACATTAGC-3′;后向,5′-CTCCTCCCTGGGTAATGG-3′。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠行為學評價結(jié)果 見表1～表3。

2.2β-細辛醚對大鼠腦CREB mRNA及蛋白表達的影響 見表4,圖1。

表1 各組大鼠Open-Field實驗水平運動結(jié)果比較

表2 各組大鼠Open-Field實驗垂直運動結(jié)果比較

表3 各組大鼠糖水偏愛度值比較

表4 各組大鼠腦CREB mRNA及蛋白表達比較

圖1 免疫組檢測各組大鼠海馬CREB蛋白表達

3 討 論

中藥在治療情志性疾病方面有自己獨特的理論體系，也積累了不少臨床上有效的方藥。石菖蒲為天南星科植物石菖蒲的干燥根莖，具有化濕和胃、開竅豁痰、醒神益智之功效，其揮發(fā)油中的主要成分：α-細辛醚(約占3.4%～13.7%)和β-細辛醚(約占63.2%～81.2%)具有較強的活性，被認為是其藥理作用的主要物質(zhì)基礎〔7〕?，F(xiàn)代藥理研究表明，石菖蒲具有較好的抗抑郁作用，石菖蒲水煎劑和氟西汀均可對抗小鼠、大鼠的失望行為，使實驗動物的絕望行為降低，具有顯著的抗抑郁效果〔8〕，但是究竟石菖蒲的哪一種化學成分在起作用目前仍不清楚。按照現(xiàn)代藥學及中藥現(xiàn)代化的要求，明確藥物主要活性成分是保證藥物安全、有效及質(zhì)量穩(wěn)定與可控的必要條件之一。因此，有必要對其有關化學成分進行深入研究。研究發(fā)現(xiàn)，大腦是β-細辛醚的重要分布器官，β-細辛醚極易透過血腦屏障進入大腦，在腦內(nèi)的半衰期比其他器官長，這也為闡明β-細辛醚對大腦的藥理作用提供了依據(jù)。

本實驗表明β-細辛醚可明顯改善抑郁癥模型動物的行為障礙表現(xiàn)。CREB活性被激活，調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄，參與神經(jīng)元的興奮、發(fā)育、凋亡以及突觸可塑性等多個神經(jīng)過程，是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的關鍵性因子之一，為抗抑郁劑受體后的共同靶標，其功能的調(diào)節(jié)代表著各種抗抑郁劑激發(fā)的信號通路的交匯點〔9〕。β-細辛醚能夠上調(diào)CREB蛋白和 mRNA的表達，提示該藥抗抑郁作用可能與調(diào)節(jié)受體后cAMP-PKA-CREB信號通路有關。β-細辛醚對抑郁癥模型大鼠的行為障礙具有明顯改善作用，并可促進海馬區(qū)CREB蛋白和mRNA的活性和表達，進而減少神經(jīng)細胞凋亡。因此，抑制抑郁癥神經(jīng)元凋亡可能為β-細辛醚抗抑郁癥的作用機制之一。

4 參考文獻

1Thomas RM,Peterson DA. A neurogenic theory of depression gains momentum〔J〕.Mol Interv,2003；3(8):441-4.

2Ren X,Dwivedi Y,Mondal AC,etal. Cyclic-AMP response element binding protein (CREB) in the neutrophils of depressed patients〔J〕.Psychiatry Res,2011；185(1-2):108-12.

3Oury F,Yadav VK,Wang Y,etal. CREB mediates brain serotonin regulation of bone mass through its expression in ventromedial hypothalamic neurons〔J〕. Genes Dev,2010；24(20):2330-42.

4Qi X,Lin W,Li J,etal. Fluoxetine increases the activity of the ERK-CREB signal system and alleviates the depressive-like behavior in rats exposed to chronic forced swim stress〔J〕.Neurobiol Dis,2008；31(2):278-85.

5陳新俊，程黎暉. 石菖蒲的藥理作用和臨床應用探討〔J〕.中草藥，2007；38(5)：附1-3.

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7魏 剛，方永奇，柯雪紅，等. 石菖蒲開竅醒神物質(zhì)基礎的藥學系列研究〔J〕.中國中醫(yī)藥信息雜志，2005；12(8)：51-3.

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9Zhang QG,Han D,Hu SQ,etal. Positive modulation of AMPA receptors prevents downregulation of GluR2 expression and activates the Lyn-ERK1/2-CREB signaling in rat brain ischemia〔J〕.Hippocampus,2010；20(1):65-77.