張江蘭 邵素霞 邢琛琨 張 靜 張文靜 張 耕 吳靖芳

(河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北 張家口 075000)

最近研究〔1，2〕發(fā)現(xiàn)三葉因子(TFF)家族在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方面具有重要的作用。Hirota 等〔3〕第一次在大鼠的脾臟中發(fā)現(xiàn)有TFF2 mRNAs和TFF3 mRNAs低水平表達(dá)，而后Cook等〔1〕在大鼠淋巴組織中發(fā)現(xiàn)也TFF2和TFF3 mRNA相關(guān)肽表達(dá)，并且在實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中h TFF2和h TFF3升高1.5～3倍，并能刺激單核細(xì)胞遷移。而對(duì)TFF3陽(yáng)性細(xì)胞定位目前國(guó)內(nèi)外還沒有進(jìn)行研究。本研究觀察實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍大鼠脾臟中TFF3的定位和表達(dá)變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與分組 8周齡SD雄性大鼠共98只。大鼠分為實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍組49只，鹽水對(duì)照組49只，體重180～220 g。北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)買。

1.2大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍模型的制作及取材 潰瘍組大鼠按冰乙酸致實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍模型方法〔4〕，用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉。胸腹部剃毛，消毒，在無(wú)菌條件下(手術(shù)切口長(zhǎng)約2 cm) 暴露胃。在胃前壁近胃竇處將0.01 ml冰醋酸注入胃黏膜下層。注射后，胃壁表面立即形成一個(gè)圓形或橢圓形的隆起，然后該處變?yōu)橐蝗榘咨煌该鲄^(qū)，直徑約5 mm。將大網(wǎng)膜覆蓋于注射區(qū)后，逐層縫合腹壁切口。鹽水對(duì)照組模擬手術(shù)，注射等量生理鹽水代替冰醋酸。兩組動(dòng)物飼養(yǎng)條件相同。取材前禁食12 h，不限飲水。動(dòng)物用30 g/L戊巴比妥鈉麻醉后，迅速開胸，主動(dòng)脈插管，剪開右心耳，首先灌注生理鹽水100 ml，繼之灌注4% 多聚甲醛250 ml，維持20 min。在造模后1、2、4、6、10、14和23 d分批迅速開腹取脾(N組7只與1 d組同時(shí)取材)，從脾截取1 cm長(zhǎng)組織條，置于Bouin′s液中固定，12 h后，將組織塊放入70%、80%、90%、酒精中各1 h，95%酒精0.5 h，100%Ⅰ酒精1 h，100%Ⅱ酒精0.5 h，二甲苯Ⅰ和Ⅱ透明各20 min，60℃下浸蠟2 h。包埋，切片，片厚5 μm，每隔50～60 μm取1 片，每張載玻片貼2片，裱貼于涂有APES的載玻片，連續(xù)切片，厚5 μm，裱貼于涂有APES的載片，行蘇木精-伊紅染色和免疫組化染色；取與免疫組化相鄰切片，連續(xù)切片，厚2 μm，裱貼于涂有APES的載片，SABC免疫組化染色。

1.3HE染色 切片經(jīng)脫蠟、染色、脫水、透明和封片，進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.4免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)脾臟TFF3的定位和表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，進(jìn)行枸櫞酸緩沖液(pH6.0)92℃～98℃水浴鍋修復(fù)10 min，室溫冷卻；作定位研究的鄰片以枸櫞酸緩沖液(pH6.0)高壓修復(fù)5 min，室溫冷卻；30 g/L H2O2-甲醇室溫20 min,100 g/L正常羊血清室溫孵育30 min ，傾去多余的血清，滴加兔抗人TFF3多克隆抗體(工作濃度為1∶150，)和兔抗鼠S-100多克隆抗體(工作濃度為1∶100)，購(gòu)自武漢博士得生物技術(shù)有限公司，4℃濕盒中過夜；滴加生物素標(biāo)記Ⅱ抗，37℃孵育30 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃孵育30 min；DAB-H2O2液顯色后，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。正常兔血清代替一抗作陰性對(duì)照，其余步驟相同。在光鏡下觀察TFF3和S-100陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)呈棕黃色顆粒狀分布于各細(xì)胞的胞質(zhì)中。以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.5形態(tài)計(jì)量和圖像分析 用OLYMPUS-CX31顯微鏡連接MiE顯微圖像處理軟件在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行觀察，用Motic Med6.0軟件進(jìn)行圖像半定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，每組動(dòng)物隨機(jī)選擇30張照片，用Motic Med6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定TFF3蛋白的平均光密度值(AOD)。

2 結(jié) 果

2.1TFF3陽(yáng)性細(xì)胞的定位 三組大鼠脾臟組織中均有TFF3表達(dá)。TFF3陽(yáng)性細(xì)胞分布于邊緣區(qū)、白髓及紅髓中的脾索中(圖1)。TFF3陽(yáng)性反應(yīng)物呈棕黃色顆粒狀分布于胞質(zhì)中。正常組TFF3細(xì)胞呈淺棕黃色，數(shù)量少；潰瘍組和鹽水組陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，數(shù)量多。白髓中TFF3陽(yáng)性細(xì)胞散在分布，形態(tài)不規(guī)則，一般有多個(gè)突起，核較大，位于細(xì)胞中央；邊緣區(qū)和紅髓中陽(yáng)性細(xì)胞成群或散在分布，數(shù)量較多；而紅髓中陽(yáng)性細(xì)胞散在分布，主要分布于脾索中。經(jīng)鄰片免疫組化結(jié)果證實(shí)，部分TFF3陽(yáng)性細(xì)胞與S-100表達(dá)陽(yáng)性重疊，因S-100是樹突細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，故脾臟中部分TFF3陽(yáng)性細(xì)胞為樹突細(xì)胞(圖2)。

2.2TFF3在不同時(shí)期大鼠脾臟中的表達(dá)變化 不同時(shí)期鹽水組(圖3A)大鼠脾臟各部位TFF3表達(dá)較弱。TFF3在不同時(shí)期胃潰瘍大鼠脾臟中各部位的表達(dá)不同，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：白髓：1、2 d組TFF3表達(dá)逐漸增強(qiáng)、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，4、6 d組染色強(qiáng)度稍有降低、數(shù)量增多，10 d 組TFF3陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度和數(shù)量達(dá)高峰(圖3B)，然后14、23 d組陽(yáng)性細(xì)胞強(qiáng)度和數(shù)量逐漸降低，但明顯高于鹽水對(duì)照組，2～23 d各潰瘍組TFF3表達(dá)均高于鹽水組(P<0.01)；邊緣區(qū)：1 d組TFF3表達(dá)逐漸增強(qiáng)、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多，2、4 d各值略有降低，6 d各值增高、陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度達(dá)峰值，10、14 d各值逐漸降低，23 d有所升高，但維持在一個(gè)較高的水平，其中6 d組與鹽水組相比明顯增高(P<0.01)。紅髓：1、2 d TFF3表達(dá)逐漸增強(qiáng)、數(shù)量增多，4 d各值降低，6 d各值增高、其陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度高峰，10、14、23 d各值下降，但維持較高水平，其中6 d組與鹽水組相比明顯增高。見表1。

表1 TFF3陽(yáng)性細(xì)胞AOD變化

圖1 潰瘍組TFF3及S-100陽(yáng)性細(xì)胞分布

圖2 潰瘍組鄰片TFF3和S-100免疫組化染色(×330)

圖3 鹽水組與潰瘍組中TFF3陽(yáng)性細(xì)胞分布(×200)

3 討 論

TFF3是Suemopr等〔5〕于1991 年在大鼠空腸黏膜中發(fā)現(xiàn)。TFF3存在單聚體及二聚體2種形式，其同源二聚體通過2個(gè)C末端半胱氨酸(Cys58)形成分子間二硫鍵連接而成，是胃腸黏膜的一個(gè)重要的保護(hù)因子，與胃腸黏膜的損傷、修復(fù)、增殖、惡變有著重要的關(guān)系〔6〕。本研究通過應(yīng)用敏感的免疫組織化學(xué)SABC法發(fā)現(xiàn)，TFF3陽(yáng)性細(xì)胞體積較大、星形或有突起，細(xì)胞核較大；也有少量表達(dá)于圓形、橢圓形的細(xì)胞中，胞核圓形或卵圓形，位于胞質(zhì)中央或偏位。DC細(xì)胞質(zhì)可以合成一種為S-100的胞漿蛋白，八九十年代以來，陸續(xù)有研究報(bào)道〔7，8〕S-100蛋白是郎交錯(cuò)突細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志。本研究結(jié)果證實(shí)部分TFF3陽(yáng)性細(xì)胞與鄰片中S-100陽(yáng)性DC重合，提示這部分TFF3陽(yáng)性細(xì)胞是S-100陽(yáng)性的DC，故認(rèn)為部分TFF3是由S-100陽(yáng)性的DC合成的。

研究〔9〕顯示，脾臟體積增大，白髓脾小體增多，且生發(fā)中心清晰。B細(xì)胞受到特異性抗原刺激增殖活化，轉(zhuǎn)化為效應(yīng)細(xì)胞漿細(xì)胞，漿細(xì)胞分泌免疫球蛋白后，大部分免疫球蛋白發(fā)生糖基化比如黏合素，Cook等〔1〕用細(xì)胞質(zhì)基因組共振光譜檢測(cè)TFF2或TFF3與IgG或IgA有一定的相關(guān)性，提示可能通過影響漿細(xì)胞免疫球蛋白的分泌活動(dòng)來提高體液免疫應(yīng)答。Alision等〔10〕研究恰好解釋了制模后的第1天分泌TFF3急劇增多，指出一方面可能是由于生理應(yīng)激性引起，另一方面TFF3為早期反應(yīng)基因。本文顯示在潰瘍愈合早期TFF3高表達(dá)可能提高了脾臟的免疫反應(yīng)性，加快了胃潰瘍的愈合，胃潰瘍自愈后期，TFF3表達(dá)減弱，脾免疫作用趨于正常。

HE染色顯示在潰瘍組早期脾臟邊緣區(qū)依次增厚，可見邊緣區(qū)免疫反應(yīng)在潰瘍?cè)缙谑窃鰪?qiáng)的。DC 通過在體內(nèi)遷移而發(fā)揮強(qiáng)大的抗原提呈功能，從外周非淋巴組織遷移進(jìn)入次級(jí)淋巴組織〔11〕，如肝臟內(nèi)的DC獲取抗原后通過血液循環(huán)到脾臟〔12〕，激發(fā)抗原特異性的免疫反應(yīng)。DC移行到脾臟T細(xì)胞區(qū)定居下來,誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答,或通過激活B細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體,清除抗原性物質(zhì)。本研究認(rèn)為，潰瘍形成和愈合早期脾的組織學(xué)改變，是由于在實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍?cè)缙?，與冰乙酸刺激和局部潰瘍形成有關(guān)，黏膜免疫細(xì)胞大量處理抗原，隨淋巴細(xì)胞再循環(huán)到達(dá)脾臟，首先引起邊緣區(qū)的改變。本研究還表明，在潰瘍組損傷后的不同時(shí)間段，邊緣區(qū)TFF3表達(dá)是不同的，總體上，邊緣區(qū)TFF3的表達(dá)與損傷發(fā)生后的時(shí)間呈負(fù)相關(guān)〔9〕，可見隨潰瘍愈合，潰瘍局部抗原成分減少，TFF3表達(dá)減少。侯國(guó)存等〔13〕證實(shí)在多器官障礙綜合征早期,脾DC大量增加并從脾臟白髓邊緣區(qū)向T細(xì)胞區(qū)遷移,引發(fā)過度免疫反應(yīng)。Cook等〔1〕在體外培養(yǎng)大鼠脾臟來源的DC培養(yǎng)基中加入人糖基化的TFF2和TFF3重組體，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)hTFF2和hTFF3升高1.5～3倍，能刺激單核細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。所以我們推測(cè)潰瘍期間脾臟TFF3能促進(jìn)免疫細(xì)胞的遷移和淋巴細(xì)胞再循環(huán)，利于潰瘍大鼠自身免疫力的提高。

總之，大鼠胃潰瘍自愈期間，脾臟不同的部位TFF3表達(dá)水平不同，但胃黏膜損傷早期脾臟TFF3呈高水平表達(dá)，對(duì)提高機(jī)體免疫反應(yīng)性及促進(jìn)胃黏膜修復(fù)有重要作用。

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