張 曉 齊海智 賀志軍 胡 偉 司中州 李一寧

(鄭州大學(xué)人民醫(yī)院肝膽胰腺外科，河南 鄭州 450000)

細(xì)胞膜離子交換蛋白Na+/H+交換泵(NHE)是存在于所有真核細(xì)胞的一種跨膜蛋白，NHE1是其中最主要且最普遍存在的一種亞型，在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值和細(xì)胞容量、維持Na+和Ca2+穩(wěn)態(tài)方面起重要作用〔1〕。大量研究表明NHE1抑制劑具有保護(hù)心肌的作用〔2〕，而NHE1抑制劑在肝缺血再灌注方面研究較少〔3〕。本試驗通過比較NHE1抑制劑EIPA預(yù)處理對大鼠肝臟缺血再灌注后血清轉(zhuǎn)氨酶、肝組織中MPO活性、細(xì)胞水腫程度及肝組織Ca2+濃度的影響，探討EIPA對肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 對象與方法

1.1材料及分組 30只成年健康SD大鼠，平均體重(201.8±19.37)g，由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院實驗動物中心提供。隨機(jī)分為空白組，缺血再灌注組，EIPA預(yù)處理+缺血再灌注組(EIPA預(yù)處理組)，每組10只。

1.2實驗過程及標(biāo)本采集 大鼠在試驗前禁食12 h、禁水4 h，稱重后按3%戊巴比妥鈉1 mg/kg經(jīng)腹腔注射實施麻醉。采用Pringle′s法，用無損傷心耳鉗阻斷肝動脈和門靜脈，建立95%缺血模型?？瞻捉M開關(guān)腹不阻斷肝門；EIPA預(yù)處理組阻斷肝門前10 min注射生理鹽水+EIPA溶液(EIPA+DMSO，EIPA為粉狀藥劑，僅溶于DMSO、酒精中，故本試驗采用DMSO作為溶劑)1.0 mg/kg，然后靜滴EIPA溶液0.01 mg·kg-1·min-1，維持15 min；缺血再灌注組阻斷肝門前10 min注射等量的生理鹽水+DMSO。EIPA預(yù)處理、缺血再灌注兩組缺血時間均為30 min，再灌注2 h后取標(biāo)本。

采血時直接穿刺肝上、下腔靜脈取血，檢測血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT，AST)。取少量肝右葉肝組織，作肝組織勻漿檢測髓過氧化物酶(MPO)活性。取少量肝右葉組織測其濕/干比，了解細(xì)胞水腫程度。留干燥肝組織檢測Ca2+濃度。取少量肝左葉組織制成組織切片，檢查組織形態(tài)學(xué)。

1.3藥品，試劑和儀器 ①EIPA由美國Alexis公司提供；DMSO由加拿大Biosharp公司提供。②MPO試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4檢測方法 (1)MPO的檢測：嚴(yán)格按照MPO測試盒說明書進(jìn)行；(2)ALT，AST測定：采用半自動生化分析儀，常規(guī)生化法，由專業(yè)檢驗人員檢測；(3)肝組織水腫程度檢測：取少量肝右葉組織吸至表面干燥后，稱重，放入烤箱中干燥至恒重后再次稱重，計算濕/干比；(4)肝組織Ca2+濃度檢測：采用火焰原子吸收法檢測，由中南大學(xué)現(xiàn)代分析檢測中心專業(yè)人員操作；(5)肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：將少量肝左葉組織以10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察，由專業(yè)病理醫(yī)師對肝臟組織損傷情況進(jìn)行判定。

2 結(jié) 果

2.1各組ALT、AST、肝組織Ca2+濃度、濕/干比、MPO活性結(jié)果比較 見表1。

2.2各組肝組織病理形態(tài)學(xué)變化 分別于10×10倍及10×40倍光鏡下觀察，可見空白組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝竇正常；缺血再灌注組與EIPA預(yù)處理組均有形態(tài)學(xué)改變，且EIPA預(yù)處理組較缺血再灌注組肝細(xì)胞壞死、淤血及中性粒細(xì)胞浸潤程度均減輕，見表2。

表1 各組ALT、AST、肝組織Ca2+濃度、濕/干比、MPO活性比較

表2 100倍光鏡下各組大鼠肝病理形態(tài)學(xué)改變(n)

3 討 論

肝臟缺血再灌注損傷的確切機(jī)制不明，已知氧自由基生成和鈣超載在肝臟缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。而近年來研究表明，白細(xì)胞特別是中性粒細(xì)胞(PMN)在肝臟缺血再灌注損傷中也發(fā)揮重要作用〔4〕。

NHE1作為一種普遍存在于所有組織細(xì)胞中的管家基因，在生理條件下表達(dá)極低。以往研究表明，其在缺血再灌注時被激活，引起細(xì)胞內(nèi)Na+/Ca2+交換紊亂，最終引起鈣超載，對細(xì)胞造成傷害〔2〕。

本實驗數(shù)據(jù)表明EIPA預(yù)處理后血清轉(zhuǎn)氨酶、肝組織Ca2+濃度及濕/干比顯著降低，其原因可能為EIPA抑制了缺血期細(xì)胞缺氧代謝時由于〔pH〕i升高而被激活的NHE1，糾正了Na+的內(nèi)流與泵出失衡，抑制了細(xì)胞內(nèi)Na+超負(fù)荷，進(jìn)而間接抑制了細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而減輕了由于細(xì)胞內(nèi)鈣超載而導(dǎo)致的炎性介質(zhì)及氧自由基的生成、細(xì)胞能量代謝障礙〔5〕等。另外，EIPA降低了〔Na+〕i，防止了細(xì)胞內(nèi)滲透壓上升，避免了細(xì)胞的腫脹及微循環(huán)障礙〔6〕，從而起到保護(hù)肝細(xì)胞的作用。

Jaeschke等〔7〕在小鼠肝臟再灌注模型中發(fā)現(xiàn)PMN在再灌注初期就開始聚集并進(jìn)行性增多，用抗白細(xì)胞血清消耗白細(xì)胞后肝臟損傷的程度減輕。因此，可認(rèn)為激活的PMN是引起肝實質(zhì)細(xì)胞損傷和肝組織結(jié)構(gòu)破壞的關(guān)鍵細(xì)胞。MPO是存在于中性粒細(xì)胞內(nèi)的一種耐高溫酶，是急性炎癥階段中性粒細(xì)胞在組織中聚集程度的指標(biāo)。肝組織內(nèi)MPO含量增加說明中性粒細(xì)胞的聚集增加。

本實驗數(shù)據(jù)表明，與缺血再灌注組比較，EIPA預(yù)處理組肝組織MPO活性顯著降低。由于NHE1也是PMN上的重要亞型，且PMN的黏附和吞噬作用通常都有活化的NHE參與〔8〕。Gumina等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)NHE抑制劑具有抑制PMN積聚與黏附的作用，體外細(xì)胞實驗認(rèn)為NHE抑制劑可減弱PMN的趨化性和突發(fā)性呼吸作用〔10〕。因此，可認(rèn)為通過抑制I/R中PMN激活從而減少了PMN在肝組織內(nèi)的聚集，抑制了氧自由基、炎性介質(zhì)及水解酶類的產(chǎn)生，進(jìn)而對肝細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。病理切片中可以看出，EIPA預(yù)處理組PMN聚集程度及肝細(xì)胞變性壞死程度明顯較缺血再灌注組減輕，也說明了這一點。

4 參考文獻(xiàn)

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2陳長勛，金若敏.NHE1抑制劑對缺血及再灌流心肌的保護(hù)作用〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2001;17(5)：489-92.

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4臧秀娟，宮 麗，洪海娟，等.中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白對大鼠腎臟缺血再灌注損傷腎小管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用〔J〕.中華腎臟病雜志，2012;28(10)：804-7.

5Hosogi S，Miyazaki H，Nakajima K，etal.An inhibitor of Na(+)/H(+) exchanger (NHE)，ethyl-isopropyl amiloride (EIPA)，diminishes proliferation of MKN28 human gastric cancer cells by decreasing the cytosolicCl(-) concentration via DIDS-sensitive pathways〔J〕.Cell Physiol Biochem，2012；30(5)：1241-53.

6張 曉.Na<′+>/H<′+>交換泵抑制劑EIPA在大鼠肝熱缺血再灌注損傷模型中的實驗研究〔D〕.長沙中南大學(xué)，2006.

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