閆光志 艾郁蔥 劉力華

(吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130012)

紫草為中國(guó)藥典收載的傳統(tǒng)中草藥。萘醌類色素為其主要有效成分；具有抗炎、抗腫瘤、保肝和免疫調(diào)節(jié)、抗病毒等作用〔1〕。本研究旨在探究紫草萘醌類化合物抑制腫瘤新生血管形成的作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 50只雄性昆明小鼠購(gòu)于吉林大學(xué)動(dòng)物部。

1.2試劑 凝血第Ⅷ因子相關(guān)抗原(FⅧRAg)和平滑肌肌動(dòng)蛋白α (α-SMA)單克隆抗體均為DAKO公司產(chǎn)品。紫草萘醌類提取物由吉林省腫瘤防治研究所提取制備成為水溶制劑(命名LE)。紫草素含量與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，用RPMI1640培養(yǎng)液配制為所需濃度。

1.3腫瘤體積測(cè)量 將50只小鼠隨機(jī)分為五組,每組10只。每只小鼠的左腋窩皮下注射肝癌細(xì)胞株(Hep-A-22)細(xì)胞。皮下接種腫瘤24 h后開始給藥。陽(yáng)性對(duì)照組5-氟尿嘧啶(5-FU)腹腔注射，20 mg/kg；微乳液(LE)灌胃，劑量2.5、5.0和10.0 mg/kg。陰性對(duì)照組予以相同容積的溶劑灌胃，連用7 d。次日處死小鼠手術(shù)剝離取出腫瘤結(jié)節(jié)并稱量瘤體重量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4微血管密度(MVD)測(cè)定 采用LSAB免疫組織化學(xué)染色。FⅧRAg和α-SMA單克隆抗體的工作濃度是1∶300。結(jié)果以在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為陽(yáng)性。α-SMA染色的組織切片中,首先在100倍視野下隨機(jī)選擇血管密度高5個(gè)區(qū)和血管密度低5個(gè)區(qū)作為計(jì)數(shù)部位,最后在400倍視野下對(duì)應(yīng)計(jì)數(shù)血管個(gè)數(shù)及胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒的血管周細(xì)胞數(shù),殘存血管不做計(jì)數(shù),然后計(jì)算單位視野(400倍)平均血管數(shù),即間質(zhì)MVD。MVD的計(jì)算按Weidner報(bào)道的方法進(jìn)行:先在40倍光鏡下找到癌巢周圍間質(zhì)血管密集區(qū),然后在200倍的光鏡下計(jì)數(shù)上述4個(gè)不同區(qū)域的血管數(shù),取其平均值為血管密度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 兩組腫瘤體積及MVD的比較應(yīng)用t檢驗(yàn);VEGF的表達(dá)應(yīng)用Ridit檢驗(yàn) 。

2 結(jié) 果

2.1LE抑制Hep-A-22體內(nèi)增殖 LE對(duì)可移植性肝癌的體內(nèi)增殖具有抑制作用，三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示皮下腫瘤的體積均明顯小于陰性對(duì)照組(P<0.01)。見表1。

2.2LE抑制腫瘤組織新生血管形成 皮下接種Hep-A-22 7 d后，免疫組化染色腫瘤組織的微血管。血小板FⅧRAg的免疫組化染色結(jié)果可見陰性對(duì)照組腫瘤組織中有大量新生微小血管形成。LE給藥小鼠皮下腫瘤體積小，F(xiàn)ⅧRAg免疫組化染色顯示陽(yáng)性微血管明顯稀少，提示對(duì)新生血管形成的抑制作用。見圖1。

表1 LE抑制腫瘤Hep-A-22的體內(nèi)增殖及對(duì)新生血管形成的影響

圖1 腫瘤新生血管形成及LE的抑制作用(×100)

2.3腫瘤新生血管分析 如表1所以，應(yīng)用LE或5-FU，腫瘤體積明顯比對(duì)照組小，5-FU的抑制率高達(dá)50%。LE的抑瘤作用呈劑量依賴關(guān)系，差異顯著(P<0.05)。LE的最小劑量即2.5 mg·kg-1·d-1和5-FU給藥對(duì)腫瘤組織MVD表現(xiàn)相近程度的下調(diào)作用，均超過(guò)50%。而LE 10.0 mg/kg的MVD抑制超過(guò)70%，說(shuō)明LE與5-FU都降低腫瘤組織的MVD；而LE的此種作用更為明顯。因此，新生血管形成的抑制是LE體內(nèi)抑制Hep-A22腫瘤生長(zhǎng)的重要原因。

3 討 論

LE抗腫瘤機(jī)制研究多集中在其誘導(dǎo)凋亡方面〔2～6〕,而對(duì)腫瘤體內(nèi)血管生成的報(bào)告較少〔7〕。由于肝癌血管結(jié)構(gòu)特殊,血供豐富,抑制腫瘤血管生成對(duì)治療肝癌更具有重要意義。腫瘤的MVD被認(rèn)為是能反映腫瘤血管生成的一個(gè)指標(biāo),它不僅與腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和供氧有關(guān),而且也反映腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力。腫瘤血管的啟動(dòng)是由腫瘤細(xì)胞分泌的促內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的多種生長(zhǎng)因子所誘發(fā),如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(PDGFα)等,其中以VEGF及bFGF在實(shí)體瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中起重要作用。在眾多研究中,VEGF已被認(rèn)為與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān),抑制VEGF的活性或減少其受體(KDR)均能明顯抑制實(shí)驗(yàn)性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

Folkman等〔8〕提出，腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴新生血管形成，經(jīng)過(guò)近幾十年研究，這一觀點(diǎn)已被普遍接受，腫瘤與血管形成之間的相互作用機(jī)制也漸明確〔7〕?；谶@一理論，抑制和破壞腫瘤新生血管阻斷腫瘤血供，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壞死和阻斷轉(zhuǎn)移，可能成為治療腫瘤的新策略。腫瘤血管生成的機(jī)制不同于生理?xiàng)l件下血管生成，也不同于胚胎時(shí)期的血管生成。其特點(diǎn)既有癌細(xì)胞分裂增殖因素，也有局部炎癥和新生血管形成的改變。本研究顯示LE的最主要抗癌活性仍然是對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)及其功能的抑制。這是因?yàn)樽畲蠼o藥劑量即10 mg·kg-1·d-1，腫瘤體積比對(duì)照低50%，而MVD的減少只有30%。這說(shuō)明紫草萘醌類化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接抑制是導(dǎo)致瘤塊膨脹減速的第一要素。而MVD的減少則是紫草萘醌類化合物的間接作用；減少腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)為其機(jī)制之一。事實(shí)上，新生血管形成的機(jī)制可能相當(dāng)復(fù)雜。Furuya等〔9〕認(rèn)為，脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育和分化過(guò)程中，新生血管形成不可或缺。而對(duì)于成年人來(lái)說(shuō)，許多生理或病理狀態(tài)，例如創(chuàng)傷修復(fù)、代謝疾病、炎癥、心臟血管疾病以及腫瘤進(jìn)展都有新生血管形成參與。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展了一些與之相關(guān)的治療技術(shù)，例如調(diào)節(jié)參與新生血管作用之細(xì)胞因子可以抑制腫瘤進(jìn)展。這些治療技術(shù)中，一部分已經(jīng)進(jìn)入臨床前研究階段。然而腫瘤新生血管形成過(guò)程非常復(fù)雜，不同腫瘤有其獨(dú)特的表現(xiàn)。組織特異性、新生血管微環(huán)境以及腫瘤分化程度等因素都與之有關(guān)；甚至宿主免疫性都可能在腫瘤新生血管形成過(guò)程起一定作用。因此要想正確認(rèn)識(shí)并掌握有關(guān)的治療方法，不但需要了解新生血管形成的一般原理，而且需要了解各種疾病特異性的事件。后者涉及內(nèi)皮性前體細(xì)胞、腫瘤血管模擬、瘤性來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的分子標(biāo)志以及血管形成相關(guān)的細(xì)胞因子等問題。不可否認(rèn)，腫瘤細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)，例如本文檢查的VEGF表達(dá)，在腫瘤新生血管形成過(guò)程中是非常重要的事件；而Furuya等〔9〕提到的宿主免疫性，即癌細(xì)胞微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)對(duì)微血管形成也具有刺激作用。小鼠可移植性肝癌組織切片的免疫組化染色證明：LE不僅抑制肝癌細(xì)胞的原位生長(zhǎng)，也抑制癌細(xì)胞分泌VEGF，從而明顯抑制接種局部肝癌組織內(nèi)新生微血管的形成。

4 參考文獻(xiàn)

1黎玉紅，周曉榮.新疆紫草的研究進(jìn)展〔J〕.新疆中醫(yī)藥，2002；20(4)：75-7.

2黃 河，謝冰芬，朱孝峰，等.紫草素衍生物Syunz-7 的抗腫瘤作用及其機(jī)制的初步研究〔J〕.癌癥，2005；24(12)：1453-8.

3Wu Z，Wu L，Li L，etal.p53-mediated cell cycle arrest and apoptosis induced by shikonin via a caspase-9-dependent mechanism in human malignant melanoma A375-s2 cells〔J〕.J Pharmacol Sci，2004；94(2):166-76.

4Kuiper RA，Schellens JH，Blijham GH,etal.Clinical research on anti geogenic therapy〔J〕.Pharmacol Res,1998；37(1):1-16.

5Folkman J,D′Amore PA.Blood vessel formation：what is its molecular basis〔J〕？Cell， 1996；87(7)：1153-5.

6Staniforth V,Wang SY，Shyur LF,etal.Shikonins phytocompounds from Lithospermum erythrothizon inhibit the transcriptional activation of human tumor necrosis factor alpha promoter in vivo〔J〕.J Biotl Chem,2004；279(7):5877-85.

7劉小平，宋少柏，徐文通，等.結(jié)直腸腫瘤微血管計(jì)數(shù)及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)〔J〕.中華腫瘤雜志，1999；21(6):430.

8Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent 〔J〕？J Natl Cancer Inst，1990；82(1):4-6.

9Furuya M，Nishiyama M，Kasuya Y,etal.Pathophysiology of tumor neovascularization〔J〕.Vasc Health Risk Manag，2005;1(4)：277-90.