曹燁駿 殷文哲 及川胤昭 叢峰松

(上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240)

最近一些關(guān)于缺血再灌注的研究證實(shí)了氫氣是一種良好的抗氧化劑〔1～3〕。腦缺血再灌注損傷是因?yàn)樾柩跫?xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的超氧自由基具有毒害效應(yīng)，可使神經(jīng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，從而引起神經(jīng)元凋亡和腦組織的損傷〔4，5〕。根據(jù)研究，氫分子能夠顯著減少氧化壓力，從而抑制缺血再灌注引起的腦損傷。另有研究研究表明〔6～8〕，氫氣對(duì)于小腸、心臟及腎臟缺血再灌注損傷均有明顯的治療作用。氧化珊瑚鈣(CCH)是采用固態(tài)氫化技術(shù)生產(chǎn)的一種負(fù)氫離子(H-)粉末，遇水會(huì)緩慢釋放出氫。日本的Taneaki Oikawa等人發(fā)現(xiàn)給小鼠喂食氫化珊瑚鈣，可以增加小鼠大腦海馬內(nèi)源性抗氧化能力〔9〕。本研究通過(guò)小鼠飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用D-半乳糖構(gòu)建小鼠衰老模型，測(cè)定CCH對(duì)血清、腦組織和肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)、總抗氧化能力(T-AOC)以及Na+-K+-ATPase的影響，從而了解其抗氧化作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 昆明小鼠18只，體重(20±2)g，6周齡，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2003-0002。

1.2實(shí)驗(yàn)條件 上海交通大學(xué)閔行校區(qū)藥學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)間，室溫(24±2)℃，濕度(70±5)%，分每籠8只飼養(yǎng)，飼料由上海仕林生物科技有限公司提供。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑 CCH由日本HIC公司制造，上海全人生物科技有限公司提供；D-半乳糖(Sigma)；考馬斯亮藍(lán)R-250染色液，脫色液；SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)；MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；T-AOC試劑盒(南京建成生物工程研究所)；GSH-PX試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Na+-K+-ATPase試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.4方法

1.4.1分組、灌胃及造模 小鼠購(gòu)入試養(yǎng)2 d后，將18只小鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、模型組、CCH組，各6只。各組均采用灌胃途徑投入。灌胃30 d，灌胃體積0.2 ml/d。對(duì)照組及模型組予生理鹽水灌胃；CCH組將CCH以蒸餾水配成1 mg/ml溶液，混勻，給予灌胃(現(xiàn)配現(xiàn)用)。每天灌胃后1 h，模型組及CCH組將D-半乳糖以蒸餾水配成10 mg/ml溶液，腹腔注射0.2 ml，建立小鼠衰老模型〔10〕。

1.4.2取樣及數(shù)據(jù)測(cè)定 灌胃30 d后對(duì)小鼠進(jìn)行解剖。用摘眼球法取小鼠全血，放入5 ml離心管中，靜置2 h后，然后放入高速離心機(jī)中25 000 r/min離心3 min，取上清，再重復(fù)一次此操作后，取上清得到血清，放入離心管中待用。另取小鼠的腦和肝臟，置于生理鹽水中，洗凈表面殘留血液，放入凍存管中，在液氮中保存。SOD、MDA、T-AOC、GSH-PX、Na+-K+-ATPase的測(cè)定分別按照對(duì)應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，蛋白質(zhì)的測(cè)定用考馬斯亮藍(lán)法。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0軟件行方差分析及q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1CCH對(duì)小鼠血清的影響 與對(duì)照組比較，注射D-半乳糖能夠顯著降低血清及SOD活性，顯著提高血清MDA含量(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，CCH能夠顯著提高血清T-AOC、SOD活性及GSH-PX活性極顯著降低血清MDA含量(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.2CCH對(duì)小鼠腦組織的影響 與對(duì)照組比較，注射D-半乳糖能夠顯著降低腦組織SOD活性及GSH-PX活性，顯著提高腦組織MDA含量(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，CCH能夠顯著提高腦組織總抗氧化能力、Na+-K+-ATPase活性(P<0.05)及GSH-PX活性，顯著降低腦組織MDA含量(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表2。

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠血清SOD活性、MDA含量、GSH-PX活性及T-AOC檢測(cè)結(jié)果

2.3CCH對(duì)小鼠肝組織的影響 與對(duì)照組比較，注射D-半乳糖能夠顯著降低肝組織FAOC、SOD活性、GSH-PX活性及Na+-K+-ATPase活性(P<0.05)。與模型組比較，CCH能夠顯著提高肝組織FAOC、SOD活性及GSH-PX活性，顯著降低肝組織MDA(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 實(shí)驗(yàn)小鼠腦組織SOD活性、MDA含量、GSH-PX活性、Na+-K+-ATPase活性及T-AOC檢測(cè)結(jié)果

表3 實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織SOD活性、MDA含量、GSH-PX活性、Na+-K+-ATPase活性及T-AOC檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

D-半乳糖衰老模型是一種利用連續(xù)注射D-半乳糖，造成動(dòng)物糖代謝紊亂的衰老模型。用D-半乳糖注射小鼠后，會(huì)出現(xiàn)多項(xiàng)生化指標(biāo)的變化，包括SOD、GSH-PX活性及總抗氧化能力的降低和MDA含量的上升，這與衰老造成的變化是相一致的，證明其實(shí)一種可靠的衰老模型〔10，11〕。

人體中氧自由基的產(chǎn)生是不可避免的，當(dāng)氧自由基不斷增殖至清除不掉時(shí)就會(huì)損害機(jī)體，導(dǎo)致衰老。因此機(jī)體內(nèi)形成了一套抗氧化防御體系，包括內(nèi)源性抗氧化劑和抗氧化酶〔12〕。SOD是內(nèi)源性超氧陰離子自由基清除劑，其活性高低可部分反映機(jī)體清除自由基的能力〔13〕。GSH-PX是生物體內(nèi)廣泛存在的一類(lèi)重要的催化過(guò)氧化氫分解的酶。GSH-PX可以促進(jìn)過(guò)氧化氫與還原型谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)生成H2O及氧化型谷胱甘肽(GSSG)，阻止了H2O2源的OH·自由基的產(chǎn)生以及其觸發(fā)的膜質(zhì)的過(guò)氧化〔14，15〕。而T-AOC代表體內(nèi)酶性和非酶性抗氧化物的總體水平，可以反應(yīng)機(jī)體的健康狀況，當(dāng)一個(gè)人的總抗氧化能力降低時(shí)，易引起炎癥、免疫系統(tǒng)疾病〔16〕。 MDA含量的增加會(huì)使膜流動(dòng)性降低，通透性增加，大量Ca2+激活一系列的蛋白水解酶，引起遲發(fā)性細(xì)胞死亡〔17〕。另外，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Na+-K+-ATPase活性降低，會(huì)導(dǎo)致大量Na+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使得鈉鈣離子交換出現(xiàn)反轉(zhuǎn)，胞內(nèi)Ca2+超載，引起細(xì)胞死亡〔18〕。

CCH負(fù)氫離子(H-)粉末,是一種強(qiáng)還原劑，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以推測(cè)其抗衰老機(jī)制可能有以下兩種機(jī)制：①負(fù)氫離子通過(guò)將自身攜帶的兩個(gè)電子轉(zhuǎn)移給活性氧自由基，直接清除活性氧自由基；②通過(guò)體內(nèi)代謝途徑，負(fù)氫離子、氫氣或兩者共同作用激活機(jī)體的GSH-PX和SOD等多種內(nèi)源性抗氧化酶，使其活性提高，促進(jìn)氧自由基被還原。

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