溫世奇 陳 泉

(甘肅省人民醫(yī)院血管外科，甘肅 蘭州 730000)

血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致增殖增加是動(dòng)脈粥樣硬化及血管成型術(shù)后再狹窄等多種心血管疾病的共同基礎(chǔ)〔1，2〕。血管成型術(shù)后，局部損傷的內(nèi)皮細(xì)胞可以產(chǎn)生大量?jī)?nèi)皮素1(ET-1)，從而影響血管中膜平滑肌細(xì)胞的表型及增殖。而在體內(nèi)應(yīng)用CGRP可明顯減少內(nèi)皮剝脫術(shù)后血管平滑肌細(xì)胞增殖及內(nèi)膜增厚，且CGRP可抑制由ET誘導(dǎo)的VSMC增殖，但ET-1與CGRP影響VSMC表型轉(zhuǎn)化及增殖的分子機(jī)制尚不十分清楚〔3〕。另外，在發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的過程中，存在細(xì)胞骨架重構(gòu)，而細(xì)胞骨架重構(gòu)又是VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞發(fā)生遷移增殖等過程的基礎(chǔ)〔4〕。ET-1與CGRP是否可通過細(xì)胞骨架蛋白影響VSMC的增殖和表型轉(zhuǎn)化有待進(jìn)一步研究。本文擬探討ET-1與CGRP之間的相互作用，及通過細(xì)胞骨架蛋白對(duì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、增殖產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1試劑 胎牛血清，購自杭州四季清生物公司，M199培養(yǎng)基購自Gibco公司，real-time PCR試劑盒購自大連TaKaRa公司，ET-1與CGRP均購自Calbiochem公司，引物由北京博奧森生物工程公司合成。

1.2細(xì)胞鑒定及培養(yǎng) 首先取臍動(dòng)脈中膜層，運(yùn)用組織塊培養(yǎng)法，將其剪成1 mm3小塊，并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。將細(xì)胞傳代5代以上用于實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定分離細(xì)胞是否為VSMC。在VSMC胞質(zhì)內(nèi)可見到棕黃色顆粒，細(xì)胞核呈藍(lán)色，即可證明是VSMC〔5〕。

1.3MTT法測(cè)定ET-1及加入CGRP對(duì)VSMC生長(zhǎng)的影響 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(不加ET-1或CGRP)，ET-1組，ET-l+CGRP組。按2.0×104/cm2濃度將VSMC種植于96孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，并且在不同時(shí)間段運(yùn)用酶標(biāo)儀測(cè)其OD值。

1.43H-TdR法檢測(cè)ET-1及加入CGRP對(duì)VSMC DNA合成的影響 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將細(xì)胞以4×104/ml濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，分組同上，ET-1組每孔加入含有100 nmol/L ET-1，ET-1+CGRP組每孔加100 nmol/L ET-1和200 nmol/L CGRP的培養(yǎng)液。在不同時(shí)間段各取6個(gè)孔細(xì)胞，并向每孔中加1 μmol/L Ci3H-TdR、0.3 ml 0.3 mol/L NaOH處理，用液閃儀測(cè)定每分鐘脈沖數(shù)(cpm)。

1.5流式細(xì)胞儀測(cè)ET-1及加入CGRP對(duì)VSMC增殖周期的影響 以5×105接種細(xì)胞于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)且使細(xì)胞同步化，48 h后再換成含ET-1(100 nmol/L)或ET-1(100 nmol/L)+ CGRP(200 nmol/L) 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在12、24、36、48、72 h收集一瓶細(xì)胞，運(yùn)用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期(FCM)。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量法測(cè)ET-1及加入CGRP對(duì)VSMC骨架蛋白及表型的影響 在ET-1或ET-1+CGRP作用1、2、3、6、7 d后抽提mRNA。先運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA，再進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。按照TaKaRa試劑盒說明書采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法檢測(cè)VSMC骨架蛋白α肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、Desmin及SM22α基因的表達(dá)，引物序列：SM22α上游5′-TTCTGCCTCAACATGGCCAAC-3′，下游5′-CACCTTCACTGGCTTGGATC-3′；α-SMA上游5′-GTGGTCAGGAATAGATGTG-3′，下游5′-CTAGCTGTGAAGTCAGTGT-3′；Desmin上游5′-TCTTTATTGTTTCTGTCCAGGG-3′，下游5′-GGAAGGTCAAGAGAGAATGTCG-3′；GAPDH上游5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′，下游5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1ET-1及CGRP對(duì)VSMC生長(zhǎng)的影響 隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，ET-1組對(duì)VSMC生長(zhǎng)的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于對(duì)照組及ET-1+CGRP組(P<0.05)，加入CGRP明顯逆轉(zhuǎn)ET-1的促增殖作用(P<0.05)，見圖1。

2.2ET-1及CGRP對(duì)VSMC DNA合成的影響 與對(duì)照組比較，ET-1可以明顯促進(jìn)VSMC DNA的合成，并于48 h達(dá)到高峰，之后進(jìn)入平臺(tái)期(P<0.05)，加入CGRP后明顯逆轉(zhuǎn)ET-1促進(jìn)DNA合成作用(P<0.05)，見圖2。

2.3ET-1及CGRP對(duì)VSMC增殖周期的影響 隨時(shí)間延長(zhǎng)，12、24、36、48、72 h ET-1組細(xì)胞G0/G1期比例減少，S期細(xì)胞比例增多(P<0.05)，ET-1+CGRP組與ET-1組比較明顯降低S期細(xì)胞比例(P<0.05)，見圖3。

圖1 ET-1及加入CGRP后對(duì)VSMC生長(zhǎng)的影響

圖2 ET-1及加入CGRP后對(duì)VSMC DNA合成的影響

圖3 ET-1作用及加入CGRP后對(duì)VSMC增殖周期的影響

2.4ET-1及CGRP對(duì)VSMC表型及骨架蛋白的影響 ET-1及CGRP作用于VSMC 48 h后，與對(duì)照組及ET-1+CGRP組比較，ET-1組明顯降低收縮型VSMC表面標(biāo)記SM22α mRNA表達(dá)量(P<0.05)；ET-1+CGRP組與對(duì)照組相比，SM22α mRNA表達(dá)量沒有顯著變化(P>0.05)；ET-1及CGRP作用于VSMC 48 h后，與對(duì)照組相比，ET-1組能明顯降低細(xì)胞骨架蛋白α-SMA及Desmin的表達(dá)量(P<0.05)，而ET-1+CGRP組無明顯變化(P>0.05)；ET-1+CGRP組與ET-1組比較明顯能增加α-SMA及Desmin的表達(dá)(P<0.05)，見圖4。

圖4 ET-1及加入CGRP后對(duì)VSMC細(xì)胞表型及骨架蛋白的影響

3 討 論

研究顯示，血管內(nèi)皮損傷后，可釋放出多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化及增殖〔6〕，當(dāng)細(xì)胞由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型后極易進(jìn)入細(xì)胞周期而發(fā)生增殖，從而由中膜向內(nèi)膜遷移〔7〕。SM22α為收縮型VSMC的標(biāo)志基因，僅在收縮型VSMC中表達(dá)，它的表達(dá)量上調(diào)與下調(diào)標(biāo)志著收縮型VSMC數(shù)量的增加與減少。

本研究發(fā)現(xiàn)，ET-1可促進(jìn)VSMC的生長(zhǎng)，在加入ET-1后，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快，在第5天即達(dá)高峰，而不加ET-1及ET-1+CGRP組細(xì)胞生長(zhǎng)較慢。另外，ET-1對(duì)VSMC DNA的合成也具有促進(jìn)作用，還可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖周期，使G0/G1期細(xì)胞比例隨著增殖時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減少，S期細(xì)胞比例逐漸增高。ET-1可使 SM22α基因表達(dá)降低，并且細(xì)胞骨架蛋白α-SMA及Desmin表達(dá)量也降低，促進(jìn)VSMC由收縮型向合成型的轉(zhuǎn)化。因此，若針對(duì)VSMC增殖的S期運(yùn)用ET-1拮抗劑可能阻斷細(xì)胞增殖，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄等作用。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)以上ET-1產(chǎn)生的促進(jìn)效應(yīng)均可被CGRP逆轉(zhuǎn)，它可拮抗ET-1引起的VSMC細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化，提示CGRP對(duì)VSMC具有保護(hù)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，CGRP能夠拮抗ET-l引起的血管收縮效應(yīng)；也有人證實(shí)CGRP和ET-1對(duì)VSMC的表型轉(zhuǎn)化和增殖具有相互調(diào)節(jié)的拮抗作用〔3〕，但具體機(jī)制尚不十分清楚。另外，在發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的過程中，存在細(xì)胞骨架重構(gòu)，而細(xì)胞骨架重構(gòu)又是VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞遷移增殖等過程的基礎(chǔ)〔4〕。SM22α是收縮型VSMC標(biāo)志基因之一，它僅表達(dá)于收縮型VSMC中，這種表達(dá)特點(diǎn)提示該蛋白可能參與VSMC表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控過程，從而影響VSMC的增殖過程。目前，有關(guān)血管重塑過程中SM22α調(diào)節(jié)VSMC表型轉(zhuǎn)化的研究尚不多見。有研究發(fā)現(xiàn)，SM22α可阻止VSMC由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化進(jìn)而限制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的生長(zhǎng)〔8〕。另有研究〔9〕顯示，不同的培養(yǎng)條件可影響骨架蛋白表達(dá)及VSMC的表型轉(zhuǎn)化。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)ET-1下調(diào)SM22α，促進(jìn)其表型由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變，而CGRP上調(diào)SM22α，阻止其表型由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變。在VSMC中，α-SMA是構(gòu)成微絲的基本成分，SM22α及α-SMA均屬于肌動(dòng)蛋白，Desmin是中間絲蛋白，對(duì)細(xì)胞骨架蛋白Z形連接以及質(zhì)膜和細(xì)胞核間的連接發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這兩種基因變化趨勢(shì)與SM22α一致，在ET-1組處于低水平狀態(tài)，而在ET-1+CGRP組處于上調(diào)狀態(tài)，這些結(jié)果均提示，ET-1及CGRP可能通過SM22α、α-SMA及Desmin調(diào)節(jié)VSMC表型轉(zhuǎn)化和增殖。

但是，本實(shí)驗(yàn)只是定性探討了CGRP對(duì)ET-l誘導(dǎo)的VSMC表型變化和增殖有抑制作用，有必要下一步在劑量依賴性和時(shí)間依賴性上進(jìn)一步研究，以期進(jìn)一步了解其作用機(jī)制。

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