李曉濤 李長德 解云川 路來金

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院骨外三科，黑龍江 佳木斯 154002)

隨著現(xiàn)代交通運輸業(yè)的迅速發(fā)展，高能量致傷因素所導致的臂叢神經(jīng)根性撕脫傷患者的上肢功能部分或完全喪失，目前臨床上多采取神經(jīng)移位術(shù)或神經(jīng)根回植術(shù)的治療方法，但療效還不盡如人意〔1〕。神經(jīng)干細胞(NSCs)改變了傳統(tǒng)的成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元死亡后不可再生的觀點，利用NSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病已成為近些年來研究的熱點。雪旺細胞(SCs)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的重要組成部分，研究者〔2〕發(fā)現(xiàn)SCs能分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子、趨化因子，不但對神經(jīng)元起到營養(yǎng)、支持、保護作用，而且神經(jīng)軸突具有引導作用，還可以作為轉(zhuǎn)基因治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的移植載體。本研究綜合分析大鼠臂叢神經(jīng)根性撕脫傷后，在神經(jīng)根回植基礎(chǔ)上，采用NSCs與SCs共移植的治療效果，進而闡明細胞移植發(fā)揮治療作用的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康清潔級Wistar 大鼠(體重250～300 g)，鼠齡60～70 d，由佳木斯大學實驗動物中心提供。隨機分為A組(頸神經(jīng)根撕脫組)、B組(頸神經(jīng)根撕脫后定期回植組)、C組(頸神經(jīng)根撕脫后定期回植并NSCs移植組)、D 組(頸神經(jīng)根撕脫后定期回植并NSCs+SCs共移植組)；每組各20只。

1.2主要試劑 DMEM/F12、 B27(Gibco公司)，小鼠抗大鼠BrdU抗體、小鼠抗大鼠Nestin抗體、Forskolin、FITC標記羊多克隆抗體(Sigma公司)，小鼠抗大鼠MAP-2抗體、小鼠抗大鼠GFAP抗體、S-100 抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒、TUNEL檢測試劑盒(武漢博士德公司)。

1.3實驗方法 制備大鼠臂叢神經(jīng)根性撕脫傷小鼠100只，參照鄭圣鼐等〔3〕的制備方法，術(shù)后第7天，行神經(jīng)根回植術(shù)及細胞移植術(shù)。A組和B組分別注入5 μl生理鹽水，C組移植入標記后的5 μl NSCs，D 組分別植入標記的5 μl SCs及5 μl NSCs。于不同時間點觀察患肢功能恢復情況、神經(jīng)電生理檢測及相應脊髓損傷節(jié)段前角運動神經(jīng)元存活率的檢測。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1大體功能評價 術(shù)后4～8 w，各組均有大鼠患肢肘關(guān)節(jié)出現(xiàn)屈曲動作，且運動幅度小于30°；至術(shù)后12～20 w時，B、C、D組較A組患肢屈肘功能有明顯改善， C、D組患肢屈肘功能恢復至50～60°，D組患肢屈肘功能達到75°。

2.2神經(jīng)電生理檢測 術(shù)后第8、16周，A組誘發(fā)電位潛伏期明顯高于B、C、D組，而復合肌肉動作電位(CMAP)波幅則明顯低于其他三組。B、C、D組誘發(fā)電位潛伏期比較：B>C>D組；B、C、D組CMAP比較：B

表1 術(shù)后8 w、16 w各組肌皮神經(jīng)潛伏期(ms)和CMAP波幅(μV)的變化

2.3脊髓前角運動神經(jīng)元存活率的檢測 A組與B、C、D組比較有顯著性差異(P<0.05)；B組和C組之間比較無顯著差異(P>0.05)；B組與D組、C組與D組比較有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

表2 各組脊髓前角運動神經(jīng)元存活率(%，

3 討 論

臂叢神經(jīng)根性撕脫傷通常采取綜合性的治療手段，以神經(jīng)回植等方式重建神經(jīng)通路的連續(xù)性為基礎(chǔ)，把NSCs單獨或者聯(lián)合其他細胞移植，以及把經(jīng)過基因修飾后的NSCs移植到動物體內(nèi)，利用NSCs的多分化潛能，在損傷部位存活、增殖、分化為功能神經(jīng)元，這樣既填補了局部缺失的神經(jīng)元；又改善了局部微環(huán)境、促進神經(jīng)軸突的再生，進而改善患肢的功能。

Nakamura 等〔4〕把經(jīng)過體外擴增并標記后的人NSCs移植到臂叢根性撕脫傷的獼猴的相應脊髓節(jié)段內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人NSCs在獼猴的損傷局部可以存活及分化。獼猴患肢的自主運動功能及肌力均明顯優(yōu)于對照組。涂致遠，張文明等〔5，6〕將NSCs移植到大鼠臂叢神經(jīng)根性撕脫傷模型的相應脊髓節(jié)段前角，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：損傷后的相應脊髓節(jié)段所提供的微環(huán)境可以促進NSCs向星型膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元的方向分化，另外還發(fā)現(xiàn)移植了NSCs的大鼠其相應損傷脊髓節(jié)段內(nèi)的前角運動神經(jīng)元存活率明顯高于對照組，這提示NSCs除具有分化為功能神經(jīng)元特征外，對損傷局部瀕死的運動神經(jīng)元還有挽救作用，能明顯減少神經(jīng)根撕脫后局部神經(jīng)元的凋亡。本實驗并沒有在大鼠模型建立后立即行神經(jīng)根回植及細胞移植，而是選擇在傷后1 w行神經(jīng)根回植術(shù)及細胞移植，原因是臨床上臂叢神經(jīng)根性撕脫傷的患者往往為多器官、多系統(tǒng)的復合傷，傷情復雜，需要病情穩(wěn)定后才能進行手術(shù)，選擇1 w后進行手術(shù)則更切合實際情況。本文結(jié)果提示：SCs與損傷局部所形成的微環(huán)境更有利于NSCs向功能神經(jīng)元的方向分化。本實驗說明神經(jīng)根回植術(shù)是治療臂叢神經(jīng)根性撕脫傷的基礎(chǔ)。NSCs在相應脊髓節(jié)段內(nèi)存活、增殖、分化為具有功能的神經(jīng)元，有賴于局部通道的建立和穩(wěn)定的微環(huán)境。NSCs與SCs的聯(lián)合移植更有利于NSCs的增殖、遷移及定向分化為有功能的神經(jīng)元。

目前，對于利用NSCs與SCs共移植治療臂叢神經(jīng)根性撕脫傷的確切機制還未完全明了，可能與下列因素有關(guān)：①修復損傷脊髓的解剖結(jié)構(gòu)，使受損的神經(jīng)通路再通，這是治療受損神經(jīng)組織的物質(zhì)基礎(chǔ)。②植入到相應脊髓節(jié)段的NSCs存活后，其與受區(qū)神經(jīng)組織相互作用，可能產(chǎn)生某些細胞因子，這些細胞因子不但可以促進受損神經(jīng)組織功能的恢復，還可以促使植入的NSCs的存活、增殖及適度遷移。③SCs不僅對NSCs起到支持和保護作用，還可以持續(xù)地為NSCs提供其生長所必需的多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，創(chuàng)造穩(wěn)定的微環(huán)境，促使NSCs向功能神經(jīng)元的方向分化。

4 參考文獻

1顧玉東.臂叢神經(jīng)損傷與疾病的診治〔M〕.上海：復旦大學出版社，2001：126.

2Tuszynski MH,Weidner N,Mc Cormack M,etal.Grafts of genetically modified Schwann cells to the spinal cord:survival,axon growth,and myelination〔J〕.Cell Transplant,1998;7(2):187-96.

3鄭圣鼐,張高孟,顧玉東,等.頸胸椎前路和后路制作大鼠臂叢神經(jīng)根性撕脫傷模型探討.中華顯微外科雜志,2003；26(4):291-2.

4Nakamura M，Toyama Y，Okano H.Transplantation of neural stem cells for spinal cord injury〔J〕.Rinsho Shinkeigaku，2005；45(11):874-6.

5涂致遠,張文明,朱維欽,等.脊髓內(nèi)移植神經(jīng)干細胞對臂叢神經(jīng)根性撕脫傷后前角運動神經(jīng)元生存和修復的影響〔J〕.中國臨床康復,2005；9(26):82-5.

6張文明,涂致遠,朱維欽,等.臂叢損傷神經(jīng)干細胞脊髓前角移植后分化情況及對運動神經(jīng)元的保護作用〔J〕.中華手外科雜志,2005；21(4):241-4.