吳金瀅 趙允龍 李 賀 高曉旭 陳建光 王春梅

(北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

脂質(zhì)代謝紊亂是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)發(fā)病的關(guān)鍵因素〔1，2〕。尋找降脂保肝的新藥具有非常重要的意義。北五味子、具有斂肺滋陰、生津止瀉、寧心安神等功效，被列入國(guó)家藥典和保健食品可用原料的名單，但到目前為止均以復(fù)方制劑入藥，以單味藥入藥還沒(méi)有得到很好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用〔3〕。五味子含有多糖、木脂素等活性成分〔4〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明五味子多糖(SCP)具有提高免疫力、保護(hù)肝臟、調(diào)節(jié)血脂代謝、降低血糖、減肥、抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等作用〔5～8〕。對(duì)五味子及其有效成分在保護(hù)肝臟的研究中，僅見(jiàn)有防治化學(xué)性及酒精性肝損傷等作用進(jìn)行研究，但其對(duì)高脂血癥引起的NAFLD是否具有防治作用。尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)肝損傷大鼠模型，觀察SCP對(duì)高脂血癥引起的NAFLD的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物及飼料 健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，體重180～200 g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證編號(hào)：2008-0005)。普通飼料成分及其熱量：脂肪5%，碳水化合物53%，蛋白質(zhì)23%，包括纖維素及水分在內(nèi)的其他成分占19%，總熱量為25 kJ/kg；高脂飼料成分及其熱量：膽固醇2%，膽酸鈉0.5%，丙硫氧嘧啶0.2%，脂肪22%，碳水化合物48%，蛋白質(zhì)20%，包括纖維素及水分在內(nèi)的其他成分占7.3%，總熱量為48.3 kJ/kg。大鼠采取分籠飼養(yǎng)，并維持12 h∶12 h晝夜循環(huán)，每日喂食，自由采食、飲水。

1.1.2藥品與試劑 SCP由北華大學(xué)林學(xué)院食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室優(yōu)選新品種，首先通過(guò)超臨界CO2流體萃取，將北五味子中水溶性成分和脂溶性成分分離，然后利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈震動(dòng)、高加速度、強(qiáng)烈空化效應(yīng)及攪拌作用，經(jīng)超聲波預(yù)處理40 min進(jìn)行浸提，再經(jīng)酶法與三氯乙酸結(jié)合脫蛋白得SCP，提取率為77.6%，純度可達(dá)50%〔9,10〕；膽固醇(批號(hào)201110)，膽酸鈉(批號(hào)201111)，氨基甲酸乙酯(批號(hào)T20101026)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(批號(hào)110607-1)，甘油三酯(TG)試劑盒(批號(hào)20111031)，總膽固醇(TC)試劑盒(批號(hào)20111102)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒(批號(hào)20120410)，谷草轉(zhuǎn)氨酶試(AST)劑盒(批號(hào)20120412)。

1.1.3儀器 Infinite M200TECAN酶標(biāo)儀，瑞士TECAN集團(tuán)公司；JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎儀/粉碎機(jī)，寧波新生生物科技股份有限公司；ESJ110-4B電子分析天平，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；MH-2微量振蕩器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；GL-20G-Ⅱ飛鴿牌離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；RM2126石蠟切片機(jī)，德國(guó)Leica公司；OLympus Bx50光學(xué)顯微鏡，日本OLympus公司。

1.2方法

1.2.1高脂血癥大鼠模型的建立及分組 32只Wistar雄性大鼠，隨機(jī)分出正常對(duì)照組和正常SCP干預(yù)組各8只，以普通飼料喂養(yǎng)，其余16只用于建立高脂血癥大鼠模型，高脂飼料喂養(yǎng)。4 w后，禁食12 h，大鼠尾靜脈采血，檢測(cè)TC和TG。確定高脂血癥模型成功。將制備成功的高脂血癥大鼠16只隨機(jī)分為高脂血癥模型組和SCP治療組各8只。藥物處理組每日以SCP 50 mg/kg，連續(xù)灌胃12 w，正常對(duì)照組和模型組給予等體積溶媒灌胃12 w。

1.2.2血脂和血清轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè) 治療結(jié)束后，大鼠禁食12～16 h，烏拉坦(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血并處死動(dòng)物。大鼠約取血4～5 ml/只，分離血清，分裝入EP管，-70℃凍存待測(cè)。TC、TG、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、ALT及AST采用酶學(xué)方法檢測(cè)，具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.3肝脂質(zhì)檢測(cè) 提取肝臟脂質(zhì)，取200 mg肝組織，放入冰冷的生理鹽水中漂洗，去除殘留血液，濾紙拭干，準(zhǔn)確稱重，并迅速用手術(shù)刀片切碎，置于離心管中，按氯仿/甲醇=2∶1(V/V)混合，先加入3倍體積的甲醇，13 000 r/min電動(dòng)勻漿10 s/次，間隔30 s，連續(xù)3～5次，在冰水中進(jìn)行，再加入6倍體積的氯仿，漩渦混合器上混勻，制備成10%的肝組織勻漿。將勻漿液置恒溫振蕩器中不斷振蕩抽提24 h后，小心抽取下相脂質(zhì)層10 μl。采用酶學(xué)方法檢測(cè)肝臟組織中TC和TG，具體操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.4肝臟病理學(xué)檢測(cè) 大鼠取血后，小心分離肝臟與周?chē)M織，在相同部位取肝左葉組織塊，冷生理鹽水沖洗后，置入10%甲醛溶液固定后，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡過(guò)夜，常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋，制成4 μm石蠟切片。經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇復(fù)水后，行蘇木素-伊紅(HE)染色，再進(jìn)行梯度乙醇脫水，脫水后將組織切片中的乙醇用二甲苯置換出來(lái)。最后滴加中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血脂的比較 與正常對(duì)照組比較，模型組血清中TC、TG和LDL-C水平顯著增高(P<0.01)，HDL-C水平無(wú)明顯變化。SCP治療12 w，顯著降低了模型組血清TC、TG和LDL-C水平(P<0.05)，而對(duì)正常大鼠血脂沒(méi)有明顯影響。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血脂的比較

2.2各組大鼠肝脂質(zhì)的比較 與正常對(duì)照組比較，模型組肝組織中TC和TG水平顯著增高(P< 0.01)。SCP治療12 w，顯著降低了模型組肝組織中TC和TG水平(P< 0.01)，而對(duì)正常大鼠肝脂質(zhì)脂沒(méi)有明顯影響。見(jiàn)表2。

2.3各組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶的比較 與正常對(duì)照組比較，模型組血清中ALT和AST水平顯著增高(P< 0.01)，SCP治療12 w，顯著降低了模型組血清ALT和AST水平(P< 0.05)，而對(duì)正常大鼠肝功能沒(méi)有明顯影響。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肝臟脂質(zhì)及血清轉(zhuǎn)氨酶的比較

2.4各組大鼠肝病理學(xué)的比較 正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)呈圓形，核位于中央，胞漿染色均勻呈粉色，小葉周邊匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，小葉中央靜脈擴(kuò)張，小葉內(nèi)可見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變性，出現(xiàn)以大泡性脂肪變性為主的混合性脂肪變性，肝細(xì)胞體積增大，胞漿內(nèi)可見(jiàn)脂肪空泡，小葉內(nèi)可見(jiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死；SCP治療組與模型組相比肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，小葉內(nèi)肝細(xì)胞脂肪變性明顯減輕，偶可見(jiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肝臟病理形態(tài)的比較(HE染色,×100)

3 討 論

近年來(lái)植物多糖以其優(yōu)良的調(diào)節(jié)血脂、降血糖、調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化等功效而備受關(guān)注。五味子是我國(guó)傳統(tǒng)保肝藥，多與其他藥物合用臨床用于防治化學(xué)性及酒精性肝損傷〔11〕。依據(jù)“二次打擊學(xué)說(shuō)”，“初次打擊”是指過(guò)多的脂肪在肝臟的堆積，而脂肪沉積于肝細(xì)胞其最主要的機(jī)制為進(jìn)入肝細(xì)胞的脂肪酸(FFA)過(guò)多。肝臟線粒體氧化途徑不能滿足FFA的代謝，過(guò)量的FFA轉(zhuǎn)化為T(mén)G儲(chǔ)存于肝細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致肝內(nèi)TG的堆積。當(dāng)肝細(xì)胞內(nèi)TG合成的速度過(guò)快,肝內(nèi)合成的極低密度脂蛋白(VLDL)不能運(yùn)出肝臟清除時(shí)，則肝內(nèi)TG蓄積達(dá)到一定程度，就會(huì)形成脂肪肝〔12〕。有研究〔13〕表明，高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠血清和肝臟脂質(zhì)的含量會(huì)同步增高。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與之相符，并說(shuō)明SCP對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠血脂及肝脂質(zhì)代謝紊亂具有良好的改善作用。

血脂升高，肝中脂肪來(lái)源過(guò)多，肝功能障礙，肝合成釋放脂蛋白的功能降低及氧化脂肪酸的能力減弱；合成磷脂原料減少則影響脂蛋白的形成和輸出，從而發(fā)生肝功能異常。ALT和AST均為非特異性細(xì)胞內(nèi)功能酶，當(dāng)肝細(xì)胞壞死、細(xì)胞膜損傷時(shí)，由于肝細(xì)胞膜通透性增高，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶血液外漏，使血清ALT和AST活性增高，因此能敏感地反映肝細(xì)胞損傷與否及損傷的程度〔14〕。本研究結(jié)果顯示，SCP治療有很好的保護(hù)肝功能、逆轉(zhuǎn)肝功能異常的作用。此外，也說(shuō)明SCP治療在改善大鼠肝功能的同時(shí)也明顯減輕了高脂血癥大鼠肝臟脂肪變性。

綜上,SCP表現(xiàn)出良好的降脂保肝作用,將為SCP防治NAFLD提供理論依據(jù)。

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