郭 恪 申玉芹 丁子清 周 岳 于海蛟 林崇韜

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙周病科,吉林 長(zhǎng)春 130021)

牙周病是一種慢性感染性疾病，已有研究表明，NLRP3炎癥小體作為天然免疫的重要組分與牙周病的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系〔1，2〕。單核/巨噬細(xì)胞作為牙周宿主防御機(jī)制的重要組成部分，在動(dòng)員宿主的抗菌防御中發(fā)揮重要作用〔3〕。由于能被多種類型的病原體或危險(xiǎn)信號(hào)所激活，作為炎癥反應(yīng)的核心，NLRP3炎癥小體可能為各種炎癥性疾病的治療提供新的靶點(diǎn)〔4〕。如果能抑制NLRP3炎癥小體的激活，可能對(duì)干預(yù)牙周病具有積極作用。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，MT01是一類根據(jù)人線粒體DNA序列設(shè)計(jì)的單鏈寡脫氧核苷酸，具有選擇性免疫負(fù)調(diào)節(jié)活性，能在大鼠牙周炎模型中抑制牙槽骨吸收，并且能抑制由TLR9激活引起的固有免疫應(yīng)答反應(yīng)〔5,6〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討 MT01 對(duì)小鼠單核/巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)NLRP3 mRNA表達(dá)的影響，尋求可抑制NLRP3炎癥小體激活的方法。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 MT01(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室設(shè)計(jì)，TAKARA合成)，牙齦卟啉單胞菌Pg ATCC33277(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)，小鼠單核/巨噬細(xì)胞RAW264.7(ATCC號(hào)：TIB-71,American Type Culture Collection)，低糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國(guó))，胎牛血清(PAA公司，奧地利)，腦心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基(BHI-S,Gibco)，6孔培養(yǎng)板(COSTAR，美國(guó))，10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿(Corning公司，美國(guó))，RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量PCR試劑盒(Takara公司，日本)，超凈工作臺(tái)(蘇州宏瑞凈化，中國(guó))，CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO 公司，日本)，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)紫外分光光度儀(BIO-RAD 公司,美國(guó))，M×3005P熒光定量PCR儀(Stratagene,美國(guó))。

1.2細(xì)菌及細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1實(shí)驗(yàn)凍干菌株P(guān)g ATCC33277，復(fù)蘇，接種于新鮮配制的BHI液體培養(yǎng)基(5%無(wú)菌脫纖維羊血，5 μg/ml氯化血紅素，1 μg/ml維生素K1)37℃厭氧培養(yǎng)5～7 d，挑單克隆菌落接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，在波長(zhǎng)600 nm的紫外分光光度計(jì)下測(cè)細(xì)菌密度，調(diào)制備用。

1.2.2RAW264.7細(xì)胞，復(fù)蘇，接種于含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基中。置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)生長(zhǎng)。隔日換液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿平皿的80%～90%，用細(xì)胞刮輕柔地將貼壁的細(xì)胞刮下，吹打混勻，按1∶2傳代。

1.3人工設(shè)計(jì)合成MT01 設(shè)計(jì)合成MT01 (5′-ACC CCC TCT ACC CCC TCT ACC CCC TCT-3′)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋至母液濃度0.1 μg/μl，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4實(shí)驗(yàn)分組 將RAW264.7細(xì)胞以4.5×105個(gè)/孔接種于6孔板中。待12 h細(xì)胞完全貼壁后，換無(wú)血清的培養(yǎng)液饑餓24 h。分為Pg組、MT01組、Pg+MT01組和只加PBS的對(duì)照組。(按細(xì)菌100∶1的感染復(fù)數(shù)，MT01的工作濃度1 μg/ml分別制成不同的混合液)分別培養(yǎng)6 h。

1.5實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NLRP3 mRNA的表達(dá) 將上述分組的細(xì)胞孵育6 h后，按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，各組取4 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成CDNA，再取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 的檢測(cè)。引物由Takara公司設(shè)計(jì)合成，以GAPDH內(nèi)參基因。GAPDH 前向:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，反向:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′；NLRP3 前向:5′-GAGTTCTTCGCTGCTATGT-3′，反向:5′-ACCTTCACGTCTCGGTTC-3′。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系：引物(10 μmol)各0.5 μl，SYBR Premix Ex Taq(2×)12.5 μl，DyeII 0.5 μl，模板cDNA 2 μl，蒸餾水dH2O補(bǔ)足總體積至25 μl。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30～34 s，95℃延伸15 s，循環(huán)40次。利用M×3005 P熒光定量PCR儀聯(lián)機(jī)軟件進(jìn)行Ct值相對(duì)定量分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1RAW264.7細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)以類圓形和多邊形為主，并有較長(zhǎng)的突觸，一般以單核為主，少數(shù)有2個(gè)核。細(xì)胞生長(zhǎng)較快，5～6 d可匯合。見(jiàn)圖1。

圖1 RAW264.7細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

2.2Pg生長(zhǎng)形態(tài) 在BHI平板上厭氧培養(yǎng)5～7 d，可觀察到典型的黑色菌落。

2.3MT01干預(yù)Pg感染的RAW264.7內(nèi)NLRP3 mRNA的表達(dá) 與PBS對(duì)照組相比，MT01組NLRP3 mRNA表達(dá)最低(P<0.05)，Pg組NLRP3 mRNA表達(dá)最高(P<0.01)，Pg+MT01組NLRP3 mRNA表達(dá)低于Pg組，高于MT01組和PBS組(P<0.01)。

3 討 論

NLRP3的異常調(diào)節(jié)與炎癥性疾病密切相關(guān)，細(xì)菌、真菌及病毒等都可以通過(guò)組織損傷、代謝異常等導(dǎo)致的宿主天然免疫應(yīng)答激活NLRP3〔4〕，NLRP3在天然免疫系統(tǒng)中具有重要的調(diào)控作用〔7〕。Bostanci等〔8〕研究表明，在牙齦炎和牙周炎患者牙齦組織中NLRP3 mRNA的表達(dá)顯著高于健康組，且NLRP3 mRNA的表達(dá)與白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18呈正相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MT01對(duì)RAW264.7內(nèi)NLRP3 mRNA的表達(dá)具有顯著的抑制作用。已有的研究〔5〕表明，MT01能抑制由病原菌感染引起的過(guò)度有害的免疫反應(yīng)，維持機(jī)體的免疫平衡，防止組織細(xì)胞受到損傷前期工作發(fā)現(xiàn)，MT01對(duì)大鼠牙周炎引起的牙槽骨吸收具有明顯的抑制作用〔6〕，但其機(jī)制不明。本研究結(jié)果提示，MT01對(duì)大鼠牙周炎的調(diào)控作用可能是由于其對(duì)NLRP3激活的抑制作用引起。

作為目前公認(rèn)的牙周炎致病菌，Pg可誘導(dǎo)人單核/巨噬細(xì)胞發(fā)生壞死樣細(xì)胞死亡，且這一過(guò)程與NALP3有關(guān)〔9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Pg刺激后，巨噬細(xì)胞RAW264.7內(nèi)NLRP3 mRNA的表達(dá)異常增高，說(shuō)明Pg感染可導(dǎo)致NLRP3的激活，進(jìn)而引發(fā)一系列的免疫調(diào)控反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中采用MT01對(duì)Pg感染進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)MT01可顯著下調(diào)Pg感染所引起的RAW264.7內(nèi)NLRP3 mRNA的表達(dá)水平。

上述結(jié)果說(shuō)明MT01不僅可以抑制NLRP3 的激活，而且能夠抑制Pg感染所導(dǎo)致的NLRP3的表達(dá)，提示MT01對(duì)NLRP3活化的干預(yù)可能成為抑制牙周感染的一種策略。

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