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        何首烏提取物對血管性癡呆大鼠5-HT受體及生化指標(biāo)的影響

        2014-09-12 02:41:56易傳安胡祥上于鵬輝
        中國老年學(xué)雜志 2014年4期
        關(guān)鍵詞:記憶模型

        易傳安 汪 冶 胡祥上 于鵬輝 王 濱

        (中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院,湖南 長沙 410000)

        血管性癡呆(VD) 是由一系列腦血管因素導(dǎo)致腦組織損害引起的以認(rèn)知功能下降為特征的癡呆綜合征。有些關(guān)鍵部位的梗死(如海馬、丘腦等),最小梗死容量只要達(dá)到1~30 ml就可能發(fā)生癡呆〔1,2〕。文獻(xiàn)〔3〕報(bào)道丘腦多次發(fā)病和雙側(cè)丘腦同時(shí)發(fā)病較易引起癡呆,而且丘腦內(nèi)側(cè)部損傷導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙比丘腦其他部位尤為嚴(yán)重。

        何首烏具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨、化濁降脂等作用,主要用于血虛萎黃、眩暈耳鳴、須發(fā)早白、腰膝酸軟、肢體麻木、崩漏帶下、高脂血癥的治療。目前研究〔4,5〕表明,何首烏主要含有蒽醌、二苯乙烯苷、卵磷脂等成分,可增加衰老大鼠腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)如5-羥色胺(5-HT)、多巴胺的含量,增強(qiáng)超氧化物歧化酶活性,消除自由基對機(jī)體的損傷,對VD具有減緩癥狀、延緩衰老、神經(jīng)保護(hù)等作用,但具體作用機(jī)制尚未完全闡明。5-HT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)一種經(jīng)典的單胺類神經(jīng)遞質(zhì),與5-HT受體結(jié)合后可調(diào)控多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,參與學(xué)習(xí)記憶功能〔6〕。本課題采用何首烏提取物治療VD大鼠,觀察丘腦前核(ATN)內(nèi)5-HT受體的表達(dá)水平以及超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)的含量變化,進(jìn)一步探討VD大鼠在形成過程中的發(fā)病機(jī)制以及何首烏對其的影響。

        1 材料與方法

        1.1材料

        1.1.1動(dòng)物 SD雄性大鼠32只,體重250~350 g,由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(本實(shí)驗(yàn)主要在安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室完成),合格證號(hào):SCXK(皖):2005-001。 將大鼠隨機(jī)分成4組,每組8只,即假手術(shù)組、模型組、陽性對照組(石杉堿)和何首烏組。

        1.1.2藥品與試劑 何首烏提取物來自懷化醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中心。SOD、MDA測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

        1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 Morris水迷宮,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所產(chǎn)品;SpectraMax 190型全波長酶標(biāo)儀,美國MD公司。 LG10-2.4A型超速離心機(jī),北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品;熒光顯微鏡,日本尼康公司;-80℃超低溫冰箱,日本三洋電子有限公司產(chǎn)品。

        1.2方法

        1.2.1何首烏的提取 取熟何首烏800 g,用70%乙醇回流提取2次。在堿性環(huán)境中真空濃縮干燥制成浸膏。何首烏組每月按1 g/kg灌胃1次,共60 d。

        1.2.2大鼠VD模型的建立 采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法制作大鼠VD模型。大鼠10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉,頸部正中切口,鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,0號(hào)線結(jié)扎其遠(yuǎn)近心端,并從中間剪斷,慶大霉素消毒,縫合切口,放回籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組除不結(jié)扎和不剪斷頸總動(dòng)脈外,其余過程與VD組相同。各組大鼠于造模后第2天開始給藥,用藥組給予相應(yīng)藥物,假手術(shù)組和模型組予等容量蒸餾水60 d。

        1.2.3大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 水迷宮為一圓形不銹鋼箱,直徑160 cm、高50 cm,按方位設(shè)東南西北4個(gè)不同象限,安全平臺(tái)設(shè)于第Ⅱ象限正中,水面高于臺(tái)面2 cm,水溫控制在25℃左右。水池上方有一攝像機(jī)與計(jì)算機(jī)連接。造模后60 d測定大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。實(shí)驗(yàn)共歷時(shí)4 d,前4 d為訓(xùn)練時(shí)間,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為學(xué)習(xí)成績,第4天訓(xùn)練結(jié)束后撤去平臺(tái),進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)(90 s),記錄大鼠平臺(tái)象限游泳時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記為記憶成績。大鼠每天訓(xùn)練4次,每次訓(xùn)練間隔4 min,每次分別從4個(gè)不同的標(biāo)記點(diǎn)將大鼠于象限邊緣1/2弧度處頭朝池壁入水,同時(shí)用攝像機(jī)開始記錄大鼠找到站臺(tái)的時(shí)間,即逃避潛伏期。如大鼠在90 s內(nèi)未找到站臺(tái),由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)大鼠找到平臺(tái),潛伏期記為90 s。數(shù)據(jù)采集及圖像分析均由圖像自動(dòng)監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。

        1.2.4生化指標(biāo)檢測 各組大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉,股動(dòng)脈取血,血漿離心取上清液。根據(jù)試劑盒說明書操作,檢測血清SOD活性和MDA含量。

        1.2.5免疫組化檢測5-HT2A受體表達(dá) 大鼠腦組織石蠟切片用二甲苯和梯度酒精脫蠟至水后,置于蘇木精染液染色5 min,蒸餾水沖洗;PBS浸泡切片5 min;3%過氧化氫室溫孵育5 min,消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性,PBS沖洗3次,2 min/次;在切片上滴加10%正常山羊血清(PBS緩沖液稀釋),放置在濕盒中,室溫孵育10~15 min,封閉游離的結(jié)合位點(diǎn),減少非特異性染色;甩去多余山羊血清,勿洗,滴加一抗(抗TNF-α,用0.01 mol/L PBS緩沖液稀釋成1∶1 000),4℃孵育過夜;PBS漂洗3次,2 min/次;滴加生物素標(biāo)記的二抗(羊抗兔IgG工作液),37℃孵育30 min;PBS漂洗3次,2 min/次;滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液,37℃孵育20 min;PBS漂洗3次,2 min/次;DAB顯色,蘇木精復(fù)染。在光學(xué)顯微鏡下控制顯色時(shí)間,脫水、透明、封片。陰性對照用PBS代替一抗,按上述步驟同步進(jìn)行。

        1.2.6積分光密度值測量 在40倍鏡下,隨機(jī)選取ATN一個(gè)區(qū)域測量陽性神經(jīng)元的積分光密度值。

        2 結(jié) 果

        2.1何首烏對VD大鼠學(xué)習(xí)和記憶的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠明顯延長逃避潛伏期、縮短平臺(tái)象限游泳時(shí)間、減少穿過平臺(tái)次數(shù);與模型組比較,何首烏明顯縮短d4逃避潛伏期、增加大鼠穿過平臺(tái)次數(shù),延長平臺(tái)象限游泳時(shí)間。見表1。

        表1 何首烏對VD大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期、平臺(tái)象限游泳時(shí)間、穿過平臺(tái)次數(shù)的影響

        2.2何首烏對VD大鼠血清SOD活性和MDA含量的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織SOD活性明顯降低,MDA含量明顯升高;與模型組比較,何首烏升高SOD活性、降低MDA含量。見表2。

        2.3各組大鼠ATN內(nèi)5-HT2A受體的免疫組化表達(dá) 抗5-HT2A受體的陽性細(xì)胞呈棕黃色,胞體呈圓形或橢圓形,胞質(zhì)無色透明,胞核著藍(lán)色絲狀顆粒,細(xì)胞膜有環(huán)形黃帶。模型組與何首烏組、陽性對照組、正常組比較,抗5-HT2A受體的陽性細(xì)胞膜的環(huán)形帶染色較深、厚度增加。積分光密度值測量,模型組與何首烏組、陽性對照組、假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

        表2 何首烏對VD大鼠血清SOD活性和MDA含量的影響

        何首烏組

        模型組

        陽性對照組

        假手術(shù)組

        3 討 論

        VD的發(fā)病機(jī)制主要包括神經(jīng)元能量衰竭、興奮性氨基酸毒性、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基產(chǎn)生、炎癥免疫反應(yīng)、再灌注損傷等,但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。文獻(xiàn)〔7〕報(bào)道,5-HT系統(tǒng)受損與VD的認(rèn)知功能下降及行為、情緒改變有關(guān)。服用5-HT受體阻滯劑可以改善病人的情緒障礙、改善病人的認(rèn)知功能,其機(jī)制一方面與改善腦循環(huán)有關(guān);另一方面與直接作用于5-HT受體,改善神經(jīng)傳遞功能有關(guān)。

        丘腦內(nèi)部結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜,是所有感覺入皮質(zhì)前的整合站,以往對癡呆的研究主要集中在海馬腦區(qū),對丘腦研究甚少。學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能并不局限于大腦的某個(gè)特定區(qū)域,單一的腦區(qū)并不能獨(dú)立完成復(fù)雜的記憶功能,學(xué)習(xí)記憶的實(shí)現(xiàn)需要多個(gè)腦區(qū)的綜合作用〔8〕?,F(xiàn)已證明,海馬等邊緣皮質(zhì)和ATN與空間位置的學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)〔9,10〕。解剖學(xué)研究證明二者之間存在著雙向纖維聯(lián)系,ANT傳出纖維主要投射至海馬下腳Ⅰ~Ⅳ層,而海馬下腳返回纖維投射至ATN的背側(cè)和腹側(cè)。神經(jīng)生理學(xué)研究表明,這種回返纖維聯(lián)系的神經(jīng)元回路可能是學(xué)習(xí)記憶的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)〔11〕。

        何首烏對丘腦神經(jīng)元有保護(hù)、改善學(xué)習(xí)記憶的作用,其機(jī)制可能是5-HT神經(jīng)遞質(zhì)與突觸后膜5-HT2A受體結(jié)合后,經(jīng)G蛋白耦聯(lián)激活了腺苷酸環(huán)化酶,胞質(zhì)內(nèi)cAMP濃度增加,使蛋白激酶A(PKA)的調(diào)節(jié)亞單位和催化亞單位分離,催化亞單位使K+通道蛋白磷酸化導(dǎo)致通道關(guān)閉,從而促進(jìn)Ca2+內(nèi)流增加、動(dòng)作電位延長,使更多的突觸囊泡結(jié)合于釋放部位,有更多的神經(jīng)遞質(zhì)從神經(jīng)元釋放出來,使感覺神經(jīng)元的興奮性突觸后電位增強(qiáng),從而促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶。但進(jìn)一步的作用機(jī)制尚需實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

        細(xì)胞氧化損傷是導(dǎo)致VD的一個(gè)早期因素〔12~14〕。SOD能夠清除超氧陰離子自由基,保護(hù)細(xì)胞免受損傷,其活性間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物,其含量間接反映了細(xì)胞受自由基攻擊的脂質(zhì)過氧化程度。因此,SOD水平的高低和MDA含量能反映出腦組織細(xì)胞受氧化損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了VD患者SOD活性降低、MDA含量升高。

        中藥治療缺血缺氧性腦病,可從多個(gè)不同環(huán)節(jié)阻止缺血缺氧觸發(fā)的病理生理和生物化學(xué)過程〔15〕。何首烏提取物中含有的蒽醌、二苯乙烯苷、卵磷脂等成分,能保護(hù)腦細(xì)胞、改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶作用。

        綜上所述,何首烏治療后,VD大鼠學(xué)習(xí)記憶行為能明顯改變,ATN內(nèi)5-HT2A受體表達(dá)可恢復(fù)到正常水平。

        4 參考文獻(xiàn)

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