高天承 李姝玉 吳 瑩 田鵬飛 蘇瑋蓮 易月娥 賈德賢 王 謙

(北京中醫(yī)藥大學病理教研室，北京 100029)

腎小管上皮細胞的間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT) 在腎臟纖維化(RIF)的過程中起到了重要的作用〔1〕。在各種慢性腎病過程中，EMT可加重腎小球硬化或腎小管間質(zhì)纖維化的進程〔2〕，從而影響疾病的發(fā)展。在EMT過程中，E-cadherin、α-SMA為EMT的標志因子。中醫(yī)學沒有對糖尿病腎病(DN)或RIF完全對應的病證名稱，但根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學對本病的病理演變過程的認識，認為“消渴”是發(fā)病原因，可歸屬于中醫(yī)學“虛勞”、“關格”、“癃閉”、“小便不利”等病證范疇，并多以氣陰兩虛為主病主證。中藥黃芪、葛根為治療DN其并發(fā)癥的常用中藥，并可用于DN的治療中，據(jù)報道臨床有較好的療效〔3〕。因此，本實驗研究黃芪注射液合葛根素注射液(AIPI)對DN小鼠腎小管上皮細胞E-cadherin、α-SMA表達的影響。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級KKAy雄性小鼠36只，9～11周齡，25～28 g，購自中國醫(yī)學科學院動物中心。KKAy小鼠許可證編號：SCXK(京)2005-0013；C57BL/6J小鼠18只，雄性，9～11周齡，23～25g，C57BL/6J小鼠許可證編號：SCXK(京)2002-0003，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床研究所實驗動物中心屏障系統(tǒng)。

1.2藥物 黃芪注射液由成都地奧九泓制藥廠提供，產(chǎn)品批號：0608056；葛根素注射液，購自浙江康恩貝制藥股份有限公司，批號0601013。

1.3主要試劑與儀器 一抗：E-cadherin，兔抗鼠，北京中杉金橋生物技術有限公司；α-SMA抗體：兔抗鼠，北京博奧森生物技術有限公司。免疫組化試劑盒：HRP標記山羊抗兔IgG(二抗)及高敏過氧化物酶復合物(SABC)，武漢博士德生物工程有限公司。濃縮型DAB試劑盒：北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4動物分組及干預方法 將隨機血糖≥13.9 mmol/L的KKAy小鼠確定為糖尿病小鼠。待KKAy小鼠高脂飼養(yǎng)至14周齡時，將KKAy小鼠按隨機血糖分組：模型組(18只)：小鼠分籠飼養(yǎng)，給予高脂飼料。治療組(18只)：小鼠分籠飼養(yǎng)，給予高脂飼料。每日腹腔注射黃芪注射液(0.03 ml·10-1g·d-1)，葛根素注射液(0.013 ml·10-1g·d-1)。正常組(C57BL/6J小鼠，18只)。以上各組動物均自由飲食，飲水。分別于20周齡、24周齡和28周齡處死動物，摘眼球取血，取雙側(cè)腎臟凍存于液氮。

1.5檢測指標及方法

1.5.1一般狀態(tài)及體重變化 實驗過程中小鼠一般狀態(tài)，如精神情況，反應速度，體重變化，食量，尿量，飲水量，體毛光澤等。

1.5.2生化指標檢測 分別于20周齡、24周齡、28周齡時處死小鼠，摘除眼球取血約1 ml，離心取血清，檢測小鼠空腹血糖(FPG)、肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)。

1.5.3形態(tài)學觀察 將小鼠腎臟制成石蠟切片和電鏡切片，HE染色和masson染色后光鏡下觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)。

1.5.4免疫組化檢測相關蛋白表達 常規(guī)制作的KKAy小鼠腎組織石蠟切片，三步法免疫組化染色，按照即用型SABC法免疫組化試劑盒說明書步驟操作，一抗分別為：E-cadherin(1∶400)、α-SMA(1∶500)，用PBS(0.01 mol/L)作為陰性對照。中性樹膠封片，顯微鏡觀察；照相，保存，Image-pro Plus 5.1 圖像分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1一般狀態(tài)及體重變化 正常組小鼠精神狀態(tài)良好，反應靈敏，體重正常，而模型組小鼠精神欠佳，反應遲鈍，體重增長明顯大于正常組小鼠，食量，尿量，飲水量均大于正常組小鼠。其中，模型組與治療組小鼠分別于25,27 w時各死亡1只。模型組小鼠FPG明顯高于正常組，治療組小鼠血糖在各時間點均低于模型組(P<0.01)。在BUN，Scr的比較中，治療組小鼠指標均低于模型組小鼠。見表1，表2。

表1 各組小鼠空腹血糖血脂變化指標

2.2各組小鼠腎臟鏡下觀察結(jié)果(圖1) 正常組小鼠HE染色顯示腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整，清楚；masson染色顯示腎間質(zhì)有少量結(jié)締組織。模型組小鼠腎小球系膜基質(zhì)增多，系膜區(qū)增寬，腎小管上皮細胞胞漿明顯空泡；masson染色顯示腎間質(zhì)有明顯結(jié)締組織增生。治療組HE染色顯示小鼠腎小球系膜基質(zhì)輕度增多，腎小管上皮細胞胞漿有少量空泡；masson染色顯示結(jié)締組織增生較模型組有所減輕。

2.3免疫組化結(jié)果

2.3.1E-cadherin免疫組化結(jié)果 正常組小鼠腎小管上皮細胞的胞漿存在E-cadherin表達(202.92±35.24)。模型組小鼠與正常組相比，腎小管上皮細胞的胞漿有少量E-cadherin表達(116.33±12.06)。治療組小鼠與模型組相比，腎小管上皮細胞胞質(zhì)E-cadherin表達較多(223.98±60.66)。圖2。

圖1 各組小鼠腎臟光鏡下形態(tài)學改變(×40)

2.3.2α-SMA 免疫組化結(jié)果 正常組小鼠腎小管上皮細胞的胞漿存在α-SMA表達(149.34±8.17)。模型組小鼠與正常組相比，腎小管上皮細胞的胞漿有大量α-SMA表達(172.12±8.32)。治療組小鼠與模型組相比，腎小管上皮細胞胞漿有少量α-SMA表達(145.58±8.52)。圖3。

圖2 E-cadherin免疫組化結(jié)果(免疫組化，×40)

圖3 α-SMA免疫組化結(jié)果(免疫組化，×40)

3 討 論

DN是糖尿病較為常見的一種常見的并發(fā)癥〔4〕，占糖尿病患者總數(shù)的67%以上〔5〕。中醫(yī)古籍中并無關于DN獨立病名記載，多在消渴病中依據(jù)其病機、癥狀描述為“虛勞”、“關格”、“癃閉”、“小便不利”等?！跋I”一名，多數(shù)醫(yī)家認為與“下消”等同，屬三消中病情較嚴重者，屬于腎病范疇，即消渴繼發(fā)水腫、脹滿、尿濁、關格等。上述論述與DN的臨床表現(xiàn)極為相似，在其綿長的病程中出現(xiàn)的尿濁、水腫、腎消等一系列表現(xiàn)均屬腎病范疇。而中醫(yī)藥在對腎纖維化的治療中，取得了一定的成果〔6〕。

DN與RIF總屬本虛標實。所謂標實，多認為是兼夾血瘀、痰飲、水濕、濁毒等，本虛則主要指氣血、陰陽、五臟六腑的虧虛。黃芪能夠補氣行血而化瘀，補氣化痰，利水消腫等，針對血瘀、痰飲、水濕等標實進行驅(qū)邪。黃芪為豆科多年生草本植物莢膜黃芪或蒙古黃芪的根，味甘，性微溫。歸脾、肺經(jīng)。功能健脾補中，升陽舉陷，益衛(wèi)固表，利尿，托毒生肌。葛根則為豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，性涼，味甘、辛。歸脾、胃兩經(jīng)為主。葛根具有解肌退熱、生津、透疹、生陽止瀉的功效。黃芪注射液為中藥黃芪的提取物，呈淡黃色液體，其主要成分為以黃芪皂苷IV為主的50余種皂苷，黃芪多糖，黃芪總黃酮，以及鐵，錳，鋅等多種微量元素。葛根素注射液本品為由豆科植物野葛或甘葛藤根中提出的一種黃酮苷，呈透明色液體，主要成分以黃酮苷為主。也有研究表明，葛根素注射液治療糖尿病腎病的機制是以降低晚期糖基化終末產(chǎn)物為主〔7〕。

EMT是一種分化完全的細胞，丟失其原有的表型特點轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌愋图毎囊环N特定的病理生理過程。通常情況下可表現(xiàn)為細胞抗凋亡和遷移能力增強，大量分泌細胞外基質(zhì)，并參與炎癥損傷修復與組織重塑〔8〕。在腎小管上皮細胞的EMT中，上皮細胞可通過內(nèi)皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化丟失原有的E-cadherin，并可表達肌成纖維細胞的標志α-SMA。

E-cadherin是一類介導細胞之間相互黏附的鈣依賴性跨膜蛋白,參與形成和維護正常細胞間的連接，廣泛存在于各類上皮細胞中。有學者認為〔9〕，E-cadherin表型的丟失是EMT過程的第一步。

α-SMA是一種肌動蛋白，其表達與肝纖維化，腎臟纖維化等多種疾病相關。而在腎小管上皮細胞EMT中，α-SMA則是EMT的主要標記蛋白，在腎臟的表達可反映肌成纖細胞的數(shù)量〔10〕。因此，在腎小管上皮細胞的EMT中，E-cadherin表達的降低，繼而表達以α-SMA為主的間充質(zhì)表型，進而加強細胞的遷移和侵襲力〔11〕。有研究表明，α-SMA在一定程度內(nèi)可以反應腎組織纖維化的程度〔12〕。

本實驗結(jié)果顯示AIPI可以降低血糖，而且對于腎臟功能具有一定的保護作用，并且在形態(tài)學改變中，治療組腎臟結(jié)構(gòu)損害較模型組有所減輕。在實驗中，模型組小鼠腎小球上皮細胞E-cadherin的表達低于正常組，α-SMA高于正常組，而治療組的腎小球上皮細胞E-cadherin的表達高于模型組，α-SMA低于正常組。初步證明AIPI對于DN的RIF中腎小管上皮細胞的EMT病變存在一定的緩解作用，為中藥針對RIF的治療提供了一定的理論依據(jù)。

4 參考文獻

1Strutz FM. EMT and proteinuria as progression factors〔J〕. Kidney Int,2009;75 (5):475-81.

2Liu YH. New insights into epithelial-mesenchymal transition in kidney fibrosis〔J〕. Am Soc Nephrol,2010;21(2):212-22.

3張永嬌.黃芪葛根湯結(jié)合怡開治療糖尿病腎病的療效觀察〔J〕.中華中醫(yī)藥學刊,2011;29(3):659-60.

4李 娜，孫 匯，王 拓,等. 糖尿病腎病發(fā)病機制研究進展〔J〕. 北華大學學報(自然科學版),2012；13(1):68-71.

5張玉金. 中醫(yī)藥治療糖尿病近況〔J〕. 遼寧中醫(yī)藥大學學報，2013;15(9)：211-3.

6朱其敏，吳 競. 中醫(yī)藥對腎纖維化的研究進展〔J〕.光明中醫(yī),2013;1(28):205-7.

7Shen JG,Yao MF,Chen XC,etal. Effects of puerarin on receptor for advanced glycation end products in nephridial tissue of streptozotocin-induced diabetic rats〔J〕. Mole Bio Reports,2009; 36(8):2229-33.

8Thiery JP, Acloque H, Huang RY,etal. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease〔J〕.Cell, 2009; 139(5): 871-90.

9Horster MF, Braun GS, Huber SF. Embryonic renal epithelia: induction, nephrogenesis，and cell differentiation〔J〕. Physiol Rev, 1999;79(4): 1157-91.

10趙德安，畢凌云，楊達勝. 桂枝茯苓膠囊對腎小管間質(zhì)纖維化大鼠α-平滑肌肌動蛋白、Ⅳ型膠原和轉(zhuǎn)化因子-β1表達的影響〔J〕.臨床兒科雜志,2013;31(1): 65-8.

11Rhyu DY, Yang Y, Ha H,etal. Role of reactive oxygen species in TGF-β1-induced mitogen-activated protein kinase activation and epithelial-mesenchymal transition in renal tubular epithelial cells〔J〕. J Am Soc Nephrol, 2005; 16(3):667-75.

12丁武杰，方敬愛，孫艷艷,等. 益腎膠囊對糖尿病腎病大鼠腎組織 JAK/STAT信號通路及α-SMA、FN 的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2013;14(6):484-6.