崔銀星 孔 菲 高普均

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院肝膽胰內(nèi)科，吉林 長春 130021)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌作為嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國呈逐年上升趨勢〔1,2〕。肝細(xì)胞癌因其早期診斷、檢查方法尚不完善，具有高復(fù)發(fā)率、高死亡率及預(yù)后差等特點(diǎn)，尋找肝細(xì)胞癌早期診斷的指標(biāo)，提高患者早期診斷率，是當(dāng)今研究的重點(diǎn)。鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅱ(AnnexinⅡ)是一類鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞黏附、分泌、遷移、增殖和凋亡、細(xì)胞骨架連接等多種生理過程〔3～6〕，與腎細(xì)胞癌、胰腺癌、小細(xì)胞肺癌和腦星形細(xì)胞瘤等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔7～10〕，但目前國內(nèi)外尚缺少AnnexinⅡ在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的研究。本研究通過檢測肝細(xì)胞癌中的組織和瘤旁組織中AnnexinⅡ表達(dá)情況，明確其在肝細(xì)胞癌表達(dá)情況及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1材料 選擇2005～2007年韓國加圖立大學(xué)首爾圣母醫(yī)院手術(shù)切除的原發(fā)性肝細(xì)胞癌腫瘤組織和瘤旁組織18例，其中男10例(55.6%)，女8例(44.4%)，標(biāo)本取出后立即放置在-80℃ 的冰箱中保存。79例肝癌石蠟組織標(biāo)本選自韓國加圖立大學(xué)首爾圣母醫(yī)院病理庫，其中男56例(70.9%)，女23例(29.1%)，年齡43～74〔平均(55±7.2)〕歲。所有患者術(shù)前均未接受放化療，并簽署知情同意。8例正常肝組織標(biāo)本選自韓國法醫(yī)鑒定中心提供的正常肝石蠟組織標(biāo)本，其中男5例，女3例，年齡40～72〔平均(48±7.4)〕歲。本研究已獲得韓國生命倫理審核委員會批準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 研究使用的試劑主要包括：鼠抗人AnnexinⅡ單克隆抗體(Santa Cruz)，辣根過氧化物酶標(biāo)記鵝抗鼠IgG(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ),鼠抗人β-actin單克隆抗體(Sigma)，Western印跡法蛋白定量試劑盒(PIERCE,USA)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白參照物Marker(PIERCE,USA)，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)印膜(Whatman,Maidstone,Kent,UK)，抗體稀釋液(Gloden Bridge,Mukilteo,WA)，聚合物檢測系統(tǒng)(Gloden Bridge,Mukilteo,WA)。

1.3Western印跡檢測方法 從冰凍肝細(xì)胞癌和相應(yīng)瘤旁肝組織標(biāo)本中取0.2 cm左右大小的組織塊，加入1 000 μl裂解液，冰浴下勻漿，靜置5 h，4℃，13 000 r/min離心20 min，收集上清液。用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行蛋白定量，計(jì)算各標(biāo)本蛋白濃度，制作樣本。提取樣本經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰銨凝膠(SDS-PAGE)電泳分離后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(100 V,90 min)，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，經(jīng)Tris鹽酸緩沖液(TBST)(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，0.5 ml/L Tween-20)沖洗3次，鼠抗人AnnexinⅡ單克隆抗體(1∶500)4℃孵育過夜后，棄去一抗，TBST洗膜3次，加入二抗37℃孵育2 h，TBST洗3次，用顯色試劑(ECL)覆蓋膜后，用MultiGaugeV3.0圖像分析軟件顯像并測定各樣本顯色的灰度，利用灰度值進(jìn)行比較，以β-actin作為內(nèi)對照。

1.4免疫組織化學(xué)染色方法 以4 μm厚度切片，65℃溫箱烤片30 min，常規(guī)脫蠟水化后,用pH6.0的檸檬酸鈉緩沖液微波修復(fù)，滴加由抗體稀釋液稀釋至1∶1 000的一抗4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，滴加酶標(biāo)二抗，37℃孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，以人宮頸癌腫瘤組織作為陽性對照。每一張切片在200倍視野中采集5個視野，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞在每個視野中所占的比例，陽性率=陽性細(xì)胞數(shù)/癌細(xì)胞總數(shù)×100%，5個視野的陽性率平均值即為該張切片的陽性表達(dá)水平，≥10%以上為陽性，反之為陰性。

2 結(jié) 果

2.1肝細(xì)胞癌和瘤旁組織Western 印跡檢測 18例腫瘤組織及瘤旁組織Western 印跡電泳結(jié)果顯示肝細(xì)胞癌和瘤旁肝組織中AnnexinⅡ均有表達(dá)，其中13例(72.2%)患者腫瘤組織條帶灰度高于瘤旁組織，另外5例(27.8%)患者腫瘤組織條帶灰度低于瘤旁組織，肝細(xì)胞癌腫瘤組織條帶灰度值明顯高于瘤旁組織(P=0.03)。見圖1。

2.2免疫組織化學(xué) AnnexinⅡ主要表達(dá)與腫瘤組織和瘤旁組織肝細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞膜及細(xì)胞核中表達(dá)不明顯。79例配對原發(fā)性肝細(xì)胞癌腫瘤組織表達(dá)陽性率明顯高于瘤旁組織(46.8% vs 25.3%，P=0.005)，8例正常肝組織中表達(dá)均為陰性，腫瘤組織表達(dá)陽性率明顯高于正常肝組織(P=0.019)，瘤旁組織和正常肝組織表達(dá)陽性率無顯著差異(P=0.189)。腫瘤組織中AnnexinⅡ在不同性別、年齡表達(dá)陽性率無顯著性差異(均P>0.05)。腫瘤組織中AnnexinⅡ表達(dá)陽性率與腫瘤組織分化程度和病理分級無關(guān)(均P>0.05)。見表1，圖2。

NT:癌旁組織，T：肝細(xì)胞癌腫瘤組織

表1 腫瘤組織及瘤旁組織中AnnexinⅡ表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系〔n(%)〕

A：肝細(xì)胞癌組織陽性染色;B:瘤旁組織陽性染色;C:瘤旁組織陰性染色

3 討 論

癌癥的發(fā)生發(fā)展是多基因多因素參與的復(fù)雜過程，原發(fā)性肝細(xì)胞癌屬于惡性腫瘤，在臨床病例中，肝癌發(fā)病率較高，僅次于胃癌和肺癌〔1,2〕，我國近年來的肝癌患者在不斷地增加，給患者帶來了巨大的身心痛苦。肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確，臨床對肝癌的研究一直在進(jìn)行，到目前為止也已經(jīng)取得了一定進(jìn)步，但是對于肝癌的早期診斷，還缺乏非常明確的標(biāo)準(zhǔn)，研究肝細(xì)胞癌及瘤旁組織表達(dá)差異性，可以在一定程度上對肝癌的發(fā)生發(fā)展、診斷和治療提供一定的參考依據(jù)。

以往的研究〔3～6〕已證明AnnexinⅡ?qū)ι顒影l(fā)揮著很大的作用，Dreier等〔11〕通過免疫組織化學(xué)染色對人類正常組織中AnnexinⅡ的表達(dá)情況進(jìn)行分析。AnnexinⅡ在胸腺小體、胰腺外分泌細(xì)胞、腎盂、膀胱上皮細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)；在唾液腺、賁門及胃體上皮細(xì)胞、 腺垂體、蛛網(wǎng)膜及脂肪組織等中表達(dá)較低。AnnexinⅡ在多數(shù)腫瘤中表達(dá)高于正常組織〔7～10〕，但在前列腺癌中為低表達(dá)或表達(dá)缺如，考慮與AnnexinⅡ基因的甲基化及磷酸化有關(guān)〔12,13〕。AnnexinⅡ在肝癌中的表達(dá)相關(guān)報(bào)道較少，1990年美國學(xué)者Frohlie等〔14〕首次報(bào)道AnnexinⅡ在肝癌中的表達(dá)明顯高于正常肝組織。

本研究AnnexinⅡ在肝細(xì)胞癌中表達(dá)水平增高，與以往研究結(jié)果相一致〔15〕。AnnexinⅡ在腫瘤組織表達(dá)高于瘤旁組織及正常肝組織，提示AnnexinⅡ參與腫瘤形成，待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證，其可能成為肝細(xì)胞癌新的診斷靶點(diǎn)。

腫瘤組織中AnnexinⅡ表達(dá)陽性率與腫瘤組織分化程度和病理分級無關(guān)，這可能與此次實(shí)驗(yàn)樣本例數(shù)少有關(guān)。AnnexinⅡ在低分化的肝細(xì)胞癌及病理分級Ⅱ～Ⅲ級中有陽性表達(dá)率增高的趨勢，提示AnnexinⅡ陽性率的增高可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)和惡化程度有關(guān)。

侵襲性轉(zhuǎn)移是肝癌患者預(yù)后差的主要原因之一〔16〕，因此研究延緩或阻止侵襲性轉(zhuǎn)移是肝癌治療中的一大難題，而曾有研究表明，在腫瘤細(xì)胞中，AnnexinⅡ升高可增加纖溶酶及前組織蛋白酶B的生成，促進(jìn)蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)，降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，從而促進(jìn)腫瘤的脫落與轉(zhuǎn)移〔17〕。這對于早期診斷和治療均有較強(qiáng)的參考性，AnnexinⅡ的表達(dá)對肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后等方面的內(nèi)容則還需要進(jìn)一步的深入研究。

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