田 杰 李慧萍 任配友 劉春禹 李 銳

(長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林 長(zhǎng)春 130031)

姜黃素是姜科姜黃根莖中發(fā)現(xiàn)的一種酚性色素，研究表明，姜黃素能夠預(yù)防多種疾病，如糖尿病，肥胖，癌癥等，尤其作為一種具有良好發(fā)展前景的抗癌新藥，具有抗癌譜廣、毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，可抑制多種體外建株腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)〔1〕，其作為化學(xué)預(yù)防藥物的研究已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段〔2,3〕。在肝癌的研究方面，姜黃素對(duì)HL-7702人肝癌細(xì)胞增殖的影響尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究姜黃素對(duì)HL-7702增殖的影響明確姜黃素的抗肝癌能力，并通過觀察其對(duì)AMP蛋白激酶(AMPK)的激活作用初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 姜黃素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；HL-7702人肝癌細(xì)胞購(gòu)于ATCC；RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)于Hyclon公司；AMPK激活劑(AICAR)、AMPK抑制劑(compound C)購(gòu)自美國(guó)Selleckchem公司；抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代 HL-7702人肝癌細(xì)胞于含10%胎牛血清(BAS)的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，采用0.25%胰酶消化傳代。

1.3噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-7702細(xì)胞，消化，計(jì)數(shù)，用含10%BSA的 RPMI1640 培養(yǎng)液配制成 1×105個(gè)/ml 的細(xì)胞懸液，充分吹打后接種于 96 孔板中，100 μl/孔。 將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日加藥處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)基，換無(wú)血清的 RPMI1640，并加入MTT10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μl二甲基亞礬(DMSO)，震蕩混勻10 min 后，酶標(biāo)儀上490 nm處測(cè)定各孔的吸光度A值。 按下列公式計(jì)算：細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.3.1檢測(cè)姜黃素對(duì)細(xì)胞增殖的影響 接種于96孔板的細(xì)胞，次日貼壁后分別更換含姜黃素的培養(yǎng)液至姜黃素終濃度為0、50和100 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè) 5 個(gè)復(fù)孔。加藥48 h后以0 μmol/L姜黃素的增殖率為100%，檢測(cè)50和100 μmol/L姜黃素劑量組的細(xì)胞增殖抑制率。

1.3.2檢測(cè)姜黃素與AICAR聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞接種的次日，分別加入含0、50、100 μmol/L姜黃素，0.125 mmol/L AICAR，50 μmol/L姜黃素聯(lián)合AICAR，100 μmol/L姜黃素聯(lián)合AICAR。加藥48 h后以0 μmol/L姜黃素的增殖率為100%，檢測(cè)50、100 μmol/L姜黃素及聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制率。

1.3.3檢測(cè)姜黃素與compound C聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞接種的次日，分別加入含0、50、100 μmol/L姜黃素，0.005 mmol/L compound C，50 μmol/L姜黃素聯(lián)合compound C，100 μmol/L姜黃素聯(lián)合compound C。加藥48 h后以0 μmol/L姜黃素的增殖率為100%，檢測(cè)50、100 μmol/L姜黃素及聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制率。

1.4Western印跡方法檢測(cè)姜黃素對(duì)HL-7702細(xì)胞AMPK表達(dá)及活化的影響 HL-7702細(xì)胞分別用0、50、100 μmol/L濃度姜黃素處理48 h后，用磷酸鹽緩沖劑(PBS)洗3次，用蛋白刮將細(xì)胞刮下，超聲裂解細(xì)胞，離心，取上清蛋白溶液，蛋白定量后取40 μg蛋白加入5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，12% SDS-PAGE電泳分離，100 V轉(zhuǎn)膜1.5 h，用3% BSA的Tris鹽酸緩沖液(TBST)封閉，TBST洗膜，依次加入一抗、二抗進(jìn)行免疫結(jié)合，AP顯色。以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算相對(duì)光密度(A)值。目的蛋白的相對(duì)光密度值=(目的蛋白條帶光強(qiáng)度×平均光密度)/(同一樣品β-actin條帶光強(qiáng)度×平均光密度)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算各組光密度A值的均值與標(biāo)準(zhǔn)差。以目的蛋白的相對(duì)光密度(A)值間接表示蛋白含量。A越大，蛋白含量越高。

2 結(jié) 果

2.1姜黃素對(duì)HL-7702增殖的影響 結(jié)果顯示，與0 μmol/L劑量組相比，50 μmol/L和100 μmol/L姜黃素劑量組細(xì)胞增殖明顯受到抑制，抑制率分別為83.5%±3.1%和90.5%±3.6%(P<0.001)。

2.2姜黃素對(duì)HL-7702中AMPK表達(dá)及活化的影響 與0 μmol/L劑量組相比，50 μmol/L和100 μmol/L姜黃素劑量組細(xì)胞中AMPK及磷酸化AMPK的含量顯著增高。見圖1。

圖1 不同濃度姜黃素處理后HL-7702細(xì)胞中AMPK的表達(dá)與活化

2.3姜黃素與AICAR聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞增殖的影響 與0 μmol/L劑量組相比，單獨(dú)應(yīng)用AICAR組細(xì)胞的增殖抑制率為23.6%±6.3%(P<0.05)，與50 μmol/L和100 μmol/L劑量組相比，姜黃素與AICAR聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率無(wú)明顯改變(P>0.05)。

2.4姜黃素與compound C聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞增殖的影響 與0 μmol/L劑量組相比，單獨(dú)應(yīng)用compound C組細(xì)胞的增殖情況無(wú)明顯改變(P>0.05)；與50 μmol/L和100 μmol/L劑量組相比，姜黃素與compound C聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞的增殖抑制率分別下降至77.6%±4.9%(P<0.001)和81.1%±3.4%(P<0.01)。

2.5姜黃素與AICAR和compound C聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞增殖的影響 與單獨(dú)使用姜黃素組，以及姜黃素與AICAR聯(lián)合應(yīng)用組相比，姜黃素與AICAR和compound C聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞的增殖情況無(wú)明顯改變；與姜黃素聯(lián)合compound C組相比，姜黃素與AICAR和compound C聯(lián)合應(yīng)用后，HL-7702細(xì)胞的抑制率分別上升為84.1%±5.1%(P<0.001)和90.9%±3.6%(P<0.01)。

3 討 論

姜黃素是從姜科、天南星科一類植物的根莖中提取的天然食用色素，研究表明，姜黃素具有抗氧化、抗腫瘤、抗血管生成以及抗炎等作用〔4〕，對(duì)許多疾病還具有預(yù)防作用〔5〕，其因價(jià)格低廉、藥理作用廣泛和潛在的抗腫瘤作用而備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示姜黃素可抑制HL-7702人肝癌細(xì)胞的增殖，且抑制程度具有濃度依賴性。

Western印跡結(jié)果顯示，姜黃素作用后HL-7702細(xì)胞中AMPK與p-AMPK均上調(diào)，提示姜黃素可能通過激活A(yù)MPK從而抑制HL-7702細(xì)胞增殖。AMPK是一種高度保守的能量敏感的絲/蘇氨酸激酶，其活性受 AMP/ATP 比例調(diào)節(jié)〔6〕。AMPK作為“能量感受器”在糖調(diào)節(jié)及脂類代謝如脂肪酸氧化、脂肪形成、蛋白質(zhì)與膽固醇形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞及其周圍細(xì)胞中AMPK活性降低并伴隨以上生理過程發(fā)生重要改變〔7，8〕。研究證明，AMPK在細(xì)胞程序性死亡及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用〔9，10〕，因此AMPK成為腫瘤預(yù)防和治療的新靶點(diǎn)〔11〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示姜黃素與AICAR聯(lián)合使用對(duì)HL-7702增殖的抑制作用與單一使用姜黃素處理組相比無(wú)明顯差異，可能是由于姜黃素已使AMPK充分激活，聯(lián)合應(yīng)用AICAR后，AMPK并未得到進(jìn)一步的激活。而將不同濃度姜黃素聯(lián)合AMPK抑制劑compound C處理HL-7702細(xì)胞后，聯(lián)合組對(duì)HL-7702細(xì)胞增殖的抑制作用較單一姜黃素處理組減弱，提示姜黃素聯(lián)合compound C時(shí)，compound C部分抵消了姜黃素對(duì)AMPK的激活作用，故對(duì)HL-7702細(xì)胞增殖的抑制作用減弱。而三者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，AICAR與compound C對(duì)AMPK的激活和抑制作用相互抵消，進(jìn)一步證明姜黃素對(duì)HL-7702細(xì)胞增殖的抑制作用與激活A(yù)MPK有關(guān)。

4 參考文獻(xiàn)

1趙毅輝，李德俊，王順金. 姜黃素對(duì)SMMC-7721人肝癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響 〔J〕. 實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué), 2010;28(2):130-3.

2Goel A, Kunnumakkara AB, Aggarwal BB. Curcumin as “Curecumin” from kitchen to clinic〔J〕. Biochemi Pharmacol, 2008;75(4):787- 809.

3Anand P, Sundaram C, Jhurani S,etal. Curcumin and cancer: an "old-age" disease with an “age-old” solution〔J〕. Cancer Lett, 2008;267(1):133-64.

4Shieh JM, Chen YC, Lin YC,etal. Demethoxycurcumin inhibits energy metabolic and oncogenic signaling pathways through AMPK activation in triple-negative breast cancer cells〔J〕. J Agric Food Chem,2013;61(26):6366-75.

5Sa G, Das T. Anti cancer effects of curcumin:cycle of life and death 〔J〕. Cell Div, 2008;3:14.

6Hung CM, Su YH, Lin HY,etal. Demethoxycurcumin modulates prostate cancer cell proliferation ia AMPK-induced down-regulation of HSP70 and EGFR〔J〕.J Agric Food Chem, 2012;60: 8427-34.

7Kanga C, Kim E. Synergistic effect of curcumin and insulin on muscle cell glucose metabolism〔J〕. Food Chem Toxicol, 2010;48(8-9): 2366-73.

8Brown KA, Samarajeewa NU, Simpson ER. Endocrine-related cancers and the role of AMPK〔J〕. Mol Cell Endocrinol, 2013;366(2):170-9.

9Hardie DG. The AMP-activated protein kinase pathway: new players upstream and downstream〔J〕.J Cell Sci,2004;117(23):5479-87.

10Dagon Y, Avraham Y, Berry EM. AMPK activation regulates apoptosis, adipogenesis, and lipolysis by eIF2alpha in adipocytes〔J〕. Biochem Biophysi Res Commun,2006;2340(1): 43-7.

11Lee YK, Lee WS, Hwang JT,etal. Curcumin exerts antidifferentiation effect through AMPK r-PPAR- γ in 3T3-L1 adipocytes and antiproliferatory effect through AMPKr-COX-2 in cancer cells〔J〕.J Agric Food Chem, 2009;57(1):305-10 .