薛昊罡 蓋曉東 孫維琦 歷 春 齊明宇

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院骨外科，吉林 吉林 132001)

青春期啟動是以促性腺激素釋放激素(GnRH)脈沖式規(guī)律性的釋放為標(biāo)志，在大鼠中，下丘腦釋放GnRH與黃體生成素(LH)分泌至血漿有著重要的關(guān)系〔1,2〕，這表明LH的分泌是評價GnRH釋放的一個理想的指標(biāo)。本文采用重復(fù)取靜脈血樣的方法來測定其LH的分泌水平。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 所有WISTAR-IMAMICH大鼠均購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，許可證號為SCXK(滬)2010-008，所有試驗(yàn)用鼠均在清潔級動物房飼養(yǎng)和繁殖，飼養(yǎng)條件為(27±1)℃，濕度70%±4%。每日自然光照，正常飲食喂養(yǎng)。

1.2試劑與材料 PMSG、HCG購自浙江寧波激素制品廠；M16、M2、透明質(zhì)酸酶及礦物油為美國sigma公司產(chǎn)品；0.9%生理鹽水、75%酒精均自行配制。

1.3方法

1.3.1通過對WISTAR-IMAMICH大鼠受精卵進(jìn)行顯微注射和胚胎移植方法建立GnRH/EGFP轉(zhuǎn)基因大鼠 ①顯微操作和胚胎移植：將優(yōu)質(zhì)單細(xì)胞受精胚胎按每批30～40枚置于Olympus倒置顯微鏡下進(jìn)行雄原核顯微注射。為最大限度確保所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)的一致性，排除注射針的影響，整個試驗(yàn)中使用的是同一批次制備的規(guī)格基本一致的注射針，并用IM-300自動注射儀控制相同的注射壓力和劑量。注射后胚胎轉(zhuǎn)入新鮮的M16培養(yǎng)滴中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min。培養(yǎng)后倒置顯微鏡下檢查和記錄胚胎存活數(shù)。以具有完整卵胞質(zhì)膜、正常卵周隙判斷為存活，胞質(zhì)擴(kuò)散、卵周隙消失的則為死亡胚胎〔3〕。②胚胎移植：存活的單細(xì)胞胚胎經(jīng)輸卵管移植到同期發(fā)情的假孕受體WISTAR-IMAMICH大鼠體內(nèi)，雙側(cè)移植，每側(cè)8～12枚。移植后19～22 d記錄產(chǎn)子數(shù)〔4〕。③首建大鼠PCR整合檢測：抽提仔鼠尾組織DNA，并根據(jù)顯微注射序列設(shè)計(jì)一對特異性引物，上游5′-CGCTCGAGTTCCTTCACAGTAAAGGG-3′；下游：5′-CGGGATCCTCTGGGACACTGAAGTCT-3′。

1.3.2分組 選擇8～13月齡的GnRH/EGFP轉(zhuǎn)基因雌性大鼠，選擇相同月齡WISTAR-IMAMICH雌性大鼠作為對照組，其中GnRH/EGFP轉(zhuǎn)基因雌性大鼠8只，平均月齡(11.7±0.60)個月；WISTAR-IMAMICH雌性大鼠6只，平均月齡(12.1 ±0.24)個月；選擇8～13月齡的GnRH/EGFP轉(zhuǎn)基因雄性大鼠14只，平均月齡(10.6±0.8)個月，選擇相同月齡WISTAR-IMAMICH雄性大鼠7只作為對照組，平均月齡(11.2±0.16)個月。GnRH/EGFP轉(zhuǎn)基因雌性大鼠及其對照WISTAR-IMAMICH大鼠在(1.8±0.20)或(1.9±0.30)月齡行卵巢切除；而GnRH/EGFP轉(zhuǎn)基因雄性大鼠及其對照WISTAR-IMAMICH大鼠在(2.0±0.58) 或(2.6±0.60)月齡進(jìn)行閹割。

1.3.3樣品收集 在大鼠右心房頸靜脈表面插入導(dǎo)管3～5 d后，于8∶00～12∶00收集血樣1 ml，0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144、156、168、180 min各取樣1 ml，血標(biāo)本保存于-20℃冰箱備檢。

1.3.4雌二醇誘導(dǎo)的GnRH峰評價 卵巢切除4 d后，大鼠皮下注射1 μg苯甲酸雌二醇；7 d后，再給予鹽酸苯丙烯啶以誘導(dǎo)LH峰。

1.3.5交配誘導(dǎo)GnRH峰評價 經(jīng)卵巢切除12 d后，雌性轉(zhuǎn)基因大鼠(9∶00)皮下注射2 μg苯甲酸雌二醇，14 d后注射苯甲酸雌二醇500 μg(9∶00)。4 h后，將雌性大鼠與已證實(shí)的種公合籠進(jìn)行2 h的交配實(shí)驗(yàn)，并作為未交配對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后迅速將實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行安樂死，并保留其軀干、血液和大腦。

1.3.6LH測定 血清LH水平用雙抗體RIA測定，每個血標(biāo)本均進(jìn)行2管測定，取其平均值。

1.3.7c-fos免疫組化 雌二醇誘導(dǎo)組與交配誘導(dǎo)組大鼠的下丘腦切開，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，用于光鏡及免疫組化研究。

2 結(jié) 果

2.1脈沖式LH變化情況 由圖1和圖2可知非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沾笫蟮拿}沖式LH分泌較轉(zhuǎn)基因雌性大鼠的LH分泌更明顯。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)兩組大鼠的平均LH濃度和LH脈沖幅度無明顯差異，但是轉(zhuǎn)基因雌性大鼠的LH脈沖頻率明顯低于雌性對照組大鼠(P<0.05)。這種差異在圖中主要體現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因雌性大鼠中僅出現(xiàn)一次脈沖，而對照組WISTAR-IMAMICH雌性大鼠的脈沖次數(shù)則達(dá)到了3～5次，平均(4.1±0.5)次。

LH脈沖同樣也在閹割的雄性轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大鼠中出現(xiàn)(圖3、圖4)。所有的雄性大鼠在3個小時的取樣監(jiān)測中出現(xiàn)了至少2次的LH脈沖(2～6次脈沖)，其中轉(zhuǎn)基因雄性大鼠平均LH脈沖為(2.8±0.7)次，而對照組雄性大鼠的平均LH脈沖次數(shù)則達(dá)到了(2.3±0.9)，兩組雄性大鼠的LH濃度、LH脈沖幅度及LH脈沖頻率均無明顯差異(P>0.05)。

圖1 GnRH/EGFP轉(zhuǎn)基因雌性大鼠經(jīng)卵巢切除后的LH分泌情況

圖2 非轉(zhuǎn)基因WISTAR-IMAMICH雌性大鼠經(jīng)卵巢切除后的LH分泌情況

圖3 GnRH/EGFP轉(zhuǎn)基因雄性大鼠閹割后的LH分泌情況

圖4 非轉(zhuǎn)基因WISTAR-IMAMICH雄性大鼠閹割后的LH分泌情況

圖5 腦組織神經(jīng)元熒光金和EGFP標(biāo)記

2.2腦組織神經(jīng)元熒光金和EGFP標(biāo)記 采用熒光金(FG)逆行追蹤法觀察5只雌性大鼠的1 208個GnRH神經(jīng)元、4只雄性大鼠的1 310個GnRH神經(jīng)元，見圖5。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，每只雌性大鼠中被熒光金標(biāo)記的神經(jīng)元達(dá)(112±36)個，檢測率為(41.9±5.7)%；雄性大鼠達(dá)(99±20)個，檢測率為(38±7.2)%。

2.3雌二醇、交配誘導(dǎo)的GnRH分泌變化 在轉(zhuǎn)基因雌性大鼠中雌二醇誘導(dǎo)LH分泌隨時間的變化情況，其中12∶00的LH濃度較低〔(1.41±0.32)ng/ml〕，第一次明顯增加是在16∶00〔(6.82±0.72)ng/ml〕，直至22∶00 LH水平仍然處于較高水平〔(6.47±0.68)ng/ml〕，其中19∶50的LH水平最高〔(13.76±1.35)ng/ml〕。在轉(zhuǎn)基因雌性大鼠中雌二醇誘導(dǎo)激活了70%的GnRH神經(jīng)元。

在轉(zhuǎn)基因雌性大鼠中交配誘導(dǎo)的LH分泌水平明顯高于未交配的雌性WISTAR-IMAMICH大鼠〔(1.36±0.42)ng/ml〕。發(fā)生交配的雌性大鼠的60%GnRH神經(jīng)元被激活。

3 討 論

目前的研究結(jié)果顯示GnRH/EGFP轉(zhuǎn)基因雌性大鼠的陣發(fā)性GnRH分泌的脈沖頻率明顯下降(僅1次)，而正常對照雌性大鼠的脈沖頻率則與文獻(xiàn)報(bào)道一致〔5,6〕。本研究中轉(zhuǎn)基因雌性大鼠的下丘腦組織中標(biāo)記上熒光金的EGFP-GnRH神經(jīng)元比例與文獻(xiàn)中所報(bào)道的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大鼠相一致〔7,8〕，并且與轉(zhuǎn)基因雄性大鼠也相接近。鑒于在去勢大鼠中觀察到的GnRH與LH分泌之間的關(guān)系〔1,2〕，本研究說明GnRH/EGFP轉(zhuǎn)基因雌性大鼠GnRH神經(jīng)元GnRH分泌水平下降。

在本研究中，激素誘導(dǎo)和交配誘導(dǎo)均可引起GnRH峰。這說明脈沖頻率的減少并不能反映雌性大鼠的激素分泌對其整體的影響。在引起GnRH峰期間，c-fos在含有EGFP的GnRH神經(jīng)元中的表達(dá)與下丘腦對激素和交配刺激引起的GnRH峰是一致的。綜合起來看，雖然卵巢切除大鼠的激素分泌下降，但是表達(dá)有EGFP的GnRH神經(jīng)元卻可以發(fā)生交配誘導(dǎo)的神經(jīng)內(nèi)分泌反射。在這方面，最近有文獻(xiàn)報(bào)道即使相對較少的GnRH神經(jīng)元仍可以支持其GnRH分泌功能〔9〕。轉(zhuǎn)基因雌性大鼠在內(nèi)源激素刺激、外源激素治療及交配等三種狀況下會發(fā)生強(qiáng)烈的激素激增。

引起轉(zhuǎn)基因雌性大鼠LH搏動下降的原因目前尚未清楚。本研究中雄性大鼠正常的間斷性激素分泌可能本質(zhì)上并非是由于EGFP在神經(jīng)元中的表達(dá)，這可能是多種內(nèi)部和外部因素共同作用的結(jié)果，其中一些內(nèi)部或外部因素可能是調(diào)節(jié)激素搏動性分泌的主要因素。最近的相關(guān)研究表明〔10〕GnRH-EGFP轉(zhuǎn)基因雌性大鼠的GnRH神經(jīng)元的受體表達(dá)較復(fù)雜。而這些受體可能在雌性大鼠激素搏動性分泌中起著重要的作用。另外，GnRH神經(jīng)元需要整合到多種內(nèi)部或外部因素影響的下丘腦回路中(雌、雄各不相同)。據(jù)文獻(xiàn)證實(shí)GnRH神經(jīng)元的分布較為廣泛〔11〕，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大鼠的單個GnRH神經(jīng)元的高斯分布情況比較類似。但是，在下丘腦上解剖定位GnRH神經(jīng)元中起到生殖調(diào)節(jié)作用的準(zhǔn)確位置卻很難。

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