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        大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞Toll樣受體表達(dá)譜

        2014-09-12 06:49:38龔長(zhǎng)銀周愛(ài)玲
        中國(guó)老年學(xué)雜志 2014年7期
        關(guān)鍵詞:純度膠質(zhì)受體

        龔長(zhǎng)銀 周愛(ài)玲

        (南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系,江蘇 南通 226001)

        近年來(lái)有研究表明,星形膠質(zhì)細(xì)胞(AS)可以通過(guò)其表面的受體,如高級(jí)糖化終產(chǎn)物受體、清道夫受體等〔1,2〕及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路〔3〕而活化胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,從而誘導(dǎo)前炎性遞質(zhì)等神經(jīng)毒性物質(zhì)的產(chǎn)生和釋放,導(dǎo)致阿爾茨海默病(AD)神經(jīng)炎癥的發(fā)生〔4,5〕。然而,對(duì)AS Toll樣受體(TLRs)的表達(dá)譜及其在AD炎癥中的可能機(jī)制的研究未見(jiàn)諸多報(bào)道。TLRs是一種跨膜模式識(shí)別受體(PRRs),能夠選擇性地識(shí)別侵入機(jī)體的病原微生物所攜帶的病原相關(guān)分子模式(PAMPs),在病原識(shí)別、啟動(dòng)和指導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮極其重要的作用〔6~8〕。本文旨在探討AS TLRs表達(dá)譜系。

        1 材料與方法

        1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生1~3 d SD大鼠,雌雄不限,由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SYXK(蘇)2002-0022。

        1.2主要試劑及儀器 DMEM/F12、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、胎牛血清(杭州四季青)、多聚賴氨酸(Sigma)、實(shí)時(shí)PCR試劑、TLRs引物(上海睿安生物科技有限公司,見(jiàn)表1)、瓊脂糖、Trizol(Invitrogen)、mouse anti-GFAP monoclonal antibody及Rabbit anti-TLR4 polyclonal antibody(Santa Cruz)、Hoechst 33342(Dojindo)。BS110S型電子天平(北京賽多利斯天平公司)、Microfuge 22R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Beckman)、-80℃超低溫冰箱(SANYO)、PHS-3C數(shù)字式酸度計(jì)(江蘇電分析儀器廠)、PTC-100 PCR儀(Bio-rad)、SX-300凝膠成像系統(tǒng)(上海四星生物技術(shù)有限公司)、小源凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海小源科技有限公司)、移液器(Eppendorf)、IX51倒置熒光相差顯微鏡(SANYO)。

        1.3AS的分離及培養(yǎng)(在無(wú)菌條件下操作) 取新生1~3 d的SD大鼠,75%乙醇浸泡消毒5~10 min,用眼科剪斷頭,在無(wú)菌條件下用眼科剪小心剪開頭骨,剝離顱骨后小心取出雙側(cè)大腦皮層,置于盛有預(yù)冷D-Hank′s液中的培養(yǎng)皿中,輕輕地剝離腦膜和血管。然后,將大腦皮層移至另一個(gè)盛有預(yù)冷D-Hank′s液的培養(yǎng)皿中,如此洗2~3遍,以盡可能的去除腦膜和血管等。最后,將大腦皮層置于盛有DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,用眼科剪將大腦皮層剪成糜狀,用巴斯德滴管轉(zhuǎn)移至離心管中,加入等體積的0.25%胰蛋白酶消化液(終濃度為0.125%),37℃下消化10 min,每5分鐘晃動(dòng)1次。然后,用含血清的培養(yǎng)基終止消化,輕輕吹打分散細(xì)胞,用不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾,1 000 r/min離心5 min。棄上清,加入含血清的培養(yǎng)基,重新混懸沉淀成單細(xì)胞懸液,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度,按(1~2)×106/ml接種于未包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中,于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中差速黏附處理30~60 min后,輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,取細(xì)胞懸液接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。每2~3天換液1次。培養(yǎng)9~14 d待細(xì)胞基本融合成單層并鋪滿瓶底后,進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。

        1.4AS的傳代純化 從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶,充分振蕩,用巴斯德吸管吸除培養(yǎng)液后,再用D-Hank′s液洗兩遍。用0.125%胰蛋白酶消化,并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,待細(xì)胞變圓,大約有2/3的細(xì)胞漂浮在液體中時(shí)立即終止消化,防止消化過(guò)度而影響AS的活力。用吸管反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶的底部,盡可能地將貼壁的細(xì)胞吹打下來(lái)。用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度,最后按照(1~2)×106/ml接種至預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸處理的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。如此,待細(xì)胞傳至3~4代后,進(jìn)行AS純度鑒定,達(dá)到要求后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        表1 PCR引物序列

        1.5AS純度鑒定 采用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和Hoechst的免疫熒光雙標(biāo)法,遵照實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程,對(duì)培養(yǎng)的AS進(jìn)行純度鑒定,并用熒光顯微鏡觀察、攝片。

        1.6實(shí)時(shí)PCR法測(cè)定AS的TLRs表達(dá)譜 按照Trizol試劑說(shuō)明書,提取AS總RNA。并用Eppendorf核酸蛋白分析儀對(duì)其定量。選擇OD260/OD280在1.8~2.0的樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)。根據(jù)試劑盒說(shuō)明,在0.2 ml EP管中,取總RNA0.1~0.5 μg組成反應(yīng)體系,于PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。RT參數(shù):42℃,60 min 70℃,5 min 4℃保存。PCR參數(shù):94℃,5 min(94℃,30 s 54℃,45 s 72℃,45 s)35個(gè)循環(huán)72℃,7 min 4℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物,電泳結(jié)束用凝膠成像系統(tǒng)拍攝并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。為了減少誤差,以TLRs與β-actin條帶密度之比表示TLRs的相對(duì)含量。

        1.7免疫熒光雙標(biāo)法測(cè)定TLR4在AS中的表達(dá)定位 依據(jù)說(shuō)明書,對(duì)純化的AS進(jìn)行TLR4和Hoechst免疫熒光染色,IX51倒置熒光相差顯微鏡下觀察定位。

        2 結(jié) 果

        2.1AS的形狀和狀態(tài) 原代培養(yǎng)24 h后開始貼壁生長(zhǎng),換液后繼續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞開始有細(xì)小的突起長(zhǎng)出。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),突出越來(lái)越多、越來(lái)越長(zhǎng),AS所占的比例越來(lái)越大。至9~10 d細(xì)胞聚集生長(zhǎng),胞體呈圓形或橢圓形,有較好的折光性,突起為兩極或三極,數(shù)量多,增殖旺盛。于倒置相差顯微鏡下觀察見(jiàn)大量AS鋪滿瓶底,并融合成單層。傳代后的AS生長(zhǎng)更為活躍,一般7 d左右即可鋪滿瓶底,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,扁平狀相互融合成片,胞質(zhì)豐富(圖1)。經(jīng)鑒定,AS純度>95%(圖2),滿足實(shí)驗(yàn)要求。

        圖1 大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)(×200)

        2.2AS TLRs表達(dá)譜 TLR1~11均有不同程度的表達(dá),但不同的TLRs表達(dá)量不同,其中TLR4表達(dá)水平相對(duì)較高,與TLR1和TLR6相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明,TLR4表達(dá)定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞膜和胞漿,是一種跨膜受體(圖3C、D、E)。因此,AS可能通過(guò)TLR4介導(dǎo)先天性或獲得性免疫反應(yīng)參與AD的炎癥發(fā)病機(jī)制假說(shuō)。

        A:GFAP,AS胞質(zhì)染成紅色; B:Hoechst33342,所有細(xì)胞核染成藍(lán)色; C:A和B的合并圖

        A:TLR1~11的瓊脂糖凝膠電泳圖,1~11:TLR1~11,12:β-actin,M:marker;B:TLR1~11相對(duì)定量柱形圖,TLR4與TLR1和 TLR6相比:1)P<0.05; C:TLR4,AS胞膜和胞質(zhì)染成綠色; D:Hoechst33342,所有細(xì)胞核染成藍(lán)色; E:C與D合并圖

        3 討 論

        AD的病理特征主要表現(xiàn)為老年斑(SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)和神經(jīng)元丟失。AD的病因和發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,迄今為止,尚未完全清楚。目前普遍認(rèn)為,它是各種因素累積效應(yīng)的結(jié)果〔9〕,例如年齡、基因突變和免疫反應(yīng)等。因此,關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制也存在著多種學(xué)說(shuō),如Aβ學(xué)說(shuō)、Tau蛋白過(guò)度磷酸化學(xué)說(shuō)、炎癥和免疫學(xué)說(shuō)等〔10〕。越來(lái)越多的證據(jù)表明,腦內(nèi)存在的慢性炎癥反應(yīng)與AD的發(fā)生發(fā)展有關(guān),在AD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用〔11~13〕。因此,提出了AD發(fā)病機(jī)制的炎癥假說(shuō),包括炎癥細(xì)胞、炎癥因子和自由基等。而且,近來(lái)的研究〔14,15〕發(fā)現(xiàn),用非甾體抗炎藥(NSAIDs)美洛昔康治療AD大鼠,可以減少腦組織內(nèi)炎癥因子的水平及抑制環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達(dá),從而延緩和抑制AD發(fā)病過(guò)程中的炎癥反應(yīng),降低AD的風(fēng)險(xiǎn)和延緩疾病的進(jìn)展。

        AS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布最廣泛的膠質(zhì)細(xì)胞,在腦內(nèi)數(shù)量最多,是神經(jīng)元數(shù)量的10倍左右〔16〕。近年來(lái),越來(lái)越多的人們關(guān)注AS,其在神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制中作用已成為研究的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,AS為神經(jīng)元提供結(jié)構(gòu)及營(yíng)養(yǎng)支持,是被動(dòng)的次要角色。近年來(lái)研究表明,AS激活可合成和分泌許多炎癥因子和細(xì)胞因子,參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的炎癥免疫反應(yīng)〔17〕,在包括AD、帕金森病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起重要的作用〔18~22〕。

        本研究將原代培養(yǎng)的AS經(jīng)過(guò)多次傳代以后,一些神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等逐漸減少,最終AS占主要地位。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)傳代后的AS生長(zhǎng)活躍,一般7 d左右即可鋪滿瓶底,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,扁平狀,相互融合成片,胞質(zhì)豐富。GFAP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中AS所獨(dú)有的細(xì)胞骨架蛋白,是公認(rèn)的AS特征性標(biāo)記物〔23~25〕。因此,本研究中采用GFAP鑒定培養(yǎng)的AS純度,結(jié)果表明,培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)3次傳代以后,AS純度達(dá)95%以上,滿足實(shí)驗(yàn)的要求。

        近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的TLRs是一組新的模式識(shí)別受體(PRRs),在很多病原微生物引起的感染性疾病和炎癥性損傷中的作用逐漸引起了人們的關(guān)注。TLRs表達(dá)于許多免疫和非免疫細(xì)胞,構(gòu)成了先天性免疫的第一道防線。目前,有大量與膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的研究,對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的作用研究比較明確,小膠質(zhì)細(xì)胞相當(dāng)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的單核巨噬細(xì)胞,表達(dá)TLR1~9〔26〕,由小膠質(zhì)細(xì)胞激活介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)加劇了腦內(nèi)神經(jīng)元的死亡,而對(duì)AS激活的作用則不夠明確。

        本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)PCR方法和免疫熒光技術(shù)對(duì)AS TLRs的表達(dá)進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,正常情況下,AS不同程度地表達(dá)TLR1~11,其中TLR4表達(dá)水平相對(duì)較高,而且TLR4定位于AS的胞膜和胞漿,是一跨膜受體。為后續(xù)探討AS參與AD神經(jīng)炎癥的可能分子機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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