馬曉燁 張旭敏 王小東 姚義安

(上海市同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200120)

隨著社會(huì)物質(zhì)生活富裕與老齡化趨勢(shì)加速，冠心病在我國(guó)的發(fā)病率也越來(lái)越高。然而血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)的增殖是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和冠狀動(dòng)脈支架術(shù)后再狹窄等的心血管疾病的重要原因〔1～3〕。在動(dòng)脈粥樣硬化形成的早期階段，VSMC受到血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF-BB)的刺激導(dǎo)致細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的增大。介入治療是嚴(yán)重狹窄的動(dòng)脈粥樣硬化的血管病變的主要治療手段，但治療時(shí)手術(shù)損傷深達(dá)中膜，激活血小板活化釋放化學(xué)因子如PDGF-BB，造成的原位損傷修復(fù)反應(yīng)能刺激VSMC的增殖和遷移，同時(shí)VSMC遷移的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致新生血管形成和顯著的血管狹窄〔4,5〕。因此，研究VSMC增殖的機(jī)制對(duì)控制動(dòng)脈粥樣硬化和支架內(nèi)再狹窄的預(yù)防有重要意義。已有研究報(bào)道，縫隙連接在動(dòng)脈粥樣硬化中起重要作用，其中縫隙連接蛋白(Cx)43在平滑肌細(xì)胞(SMC)增殖中作用明顯〔6～10〕，但Cx43表達(dá)與細(xì)胞形態(tài)變化關(guān)系尚不明確。本研究以PDGF-BB作為體外培養(yǎng)的冠狀動(dòng)脈SMC細(xì)胞的刺激源，觀察細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換與Cx43蛋白表達(dá)量的關(guān)系，探討Cx43對(duì)冠狀動(dòng)脈SMC細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的影響，從而闡明Cx43表達(dá)在冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后再狹窄中的作用。

1 材料與方法

1.1主要材料 細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM，美國(guó)GIBCO公司)培養(yǎng),20%的胎牛血清(FCS，美國(guó)GIBCO公司)、電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司Mini Protein Ⅱ型)、投射電鏡 (日本Olympus公司)、PCR儀(Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System)、光鏡觀察(日本olympus公司)、胰酶(Gibco公司)、S100A4、α-SMA 兔二抗體均為Abcam公司生產(chǎn)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)。

1.2SMC培養(yǎng) 根據(jù)同濟(jì)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，將3月齡家豬雌雄不限處死，分離冠狀動(dòng)脈前降支、回旋支、右冠狀動(dòng)脈，縱形破開(kāi)分離出中層，進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)；SMC培養(yǎng)基(DMEM，美國(guó)GIBCO公司)培養(yǎng),加入20%的FCS放入37℃，體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，逐日倒置顯微鏡觀察，每隔3 d換1次液。

1.3冠狀動(dòng)脈SMC應(yīng)用PDGF誘導(dǎo) 經(jīng)原代培養(yǎng)正常冠脈平SMC在含20%FCS的DMEM中培養(yǎng)，將貼壁90%細(xì)胞用胰酶消化1 min后，依次鋪入6孔板內(nèi)，24 h貼壁牢固后，加入PDGF-BB (10 ng/ml,Roche)共同培育，PDGF-BB濃度為10 ng/ml作用24 h；然后加入連接蛋白阻斷劑(18-α-glycyrrhetinic acid濃度100 μmol/L)阻斷作用48 h，后分別在24、48 h電鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化及連接蛋白變化〔8〕。

實(shí)驗(yàn)分為三組：正常對(duì)照組，誘導(dǎo)組：PDGF-BB(10 ng/ml)，阻斷組：PDFG-BB(10 ng/ml)+Cx43阻斷劑(100 μmol/L)。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后收集用于以下各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4電鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu) 離心收集貼壁細(xì)胞，2.5%戊二醛固定2～3 h，1%娥酸固定2～3 h，脫水臨界點(diǎn)干燥，3%醋酸鈉枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡(日本Olympus公司)觀察SMC的形態(tài)與結(jié)構(gòu)。

1.5Western 印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 采用Western 印跡方法檢測(cè)Cx43、Cx40、α-SMA、S100A4的蛋白表達(dá)。離心收集貼壁細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行樣品總蛋白含量測(cè)定，制膠，制備蛋白質(zhì)樣品并加樣，免疫印跡顯色，抗體均為Abcam公司生產(chǎn)，將膜放入曝光儀器中，滴加發(fā)光液，曝光3次，5 min/次，選擇3次曝光的重疊值。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定Cx43、Cx40 mRNA的表達(dá) Trizol一步法抽提平滑肌細(xì)胞正常對(duì)照組、誘導(dǎo)組及阻斷組冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞RNA。測(cè)定總RNA純度、濃度及RNA完整性的檢測(cè)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及cDNA合成(RT)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。放入熒光定量PCR儀(Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System)，反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動(dòng)進(jìn)行溶解曲線分析，并計(jì)算得到每個(gè)樣本的CT值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照，計(jì)算得到目的基因mRNA的含量。

2 結(jié) 果

2.1顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化 光鏡觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。通過(guò)電鏡檢查可見(jiàn)加入10 ng/ml PDFG-BB后細(xì)胞增殖加速分化。正常冠狀動(dòng)脈SMC呈紡錘狀形態(tài)(S-SMC)，胞漿內(nèi)含SMC特征性結(jié)構(gòu)肌絲和密體，細(xì)胞內(nèi)高爾基體粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體含量很少。誘導(dǎo)組呈長(zhǎng)菱形(R-SMC)，核呈鋸齒狀，核大且呈異染性，核漿比例及平均細(xì)胞直徑均較大，粗絲和密體減少，胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，游離核糖體豐富，并含有大量高爾基體。當(dāng)加入100 μmol/ml Cx43阻斷劑后又抑制增殖，細(xì)胞恢復(fù)成S-SMC，細(xì)胞內(nèi)高爾基體粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體含量減少。見(jiàn)圖2。

圖1 顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化(×100)

圖2 電鏡下結(jié)果(×200)

2.2Western 印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比，經(jīng)PDFG-BB誘導(dǎo)后，Cx43、S100A4(R-SMC的標(biāo)志)的蛋白表達(dá)量增加(P<0.01)，Cx40、α-SMA(SMC分化標(biāo)志)的蛋白表達(dá)量減少(P<0.01)；而加入Cx43阻斷劑后Cx43、S100A4的蛋白表達(dá)量減少(P<0.01)， Cx40、α-SMA蛋白表達(dá)量增加(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定mRNA的表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定mRNA的表達(dá)：在對(duì)照組，Cx40的mRNA表達(dá)較高，Cx43少量表達(dá)；與誘導(dǎo)組相比較，Cx43的mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)，Cx40表達(dá)明顯減少(P<0.01)；阻斷組通過(guò)反義RNA降低Cx43表達(dá)，這種變化受抑制，且阻斷組與誘導(dǎo)組在Cx43及Cx40mRNA的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

圖3 Western 印跡檢測(cè)誘導(dǎo)后及阻斷后蛋白變化

圖4 PDGF-BB誘導(dǎo)及阻斷Cx40、Cx43表達(dá)

3 討 論

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)是冠心病最有效治療手段之一，但術(shù)后再狹窄影響遠(yuǎn)期療效。再狹窄是一種局部血管對(duì)損傷的反應(yīng)過(guò)程，包括炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和血小板的聚集釋放各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，刺激血管中層SMC的增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)換，以及分泌細(xì)胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚以及血管狹窄〔11,12〕。

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成包括SMC從中層向內(nèi)膜的遷移，在內(nèi)膜受到PDFG等細(xì)胞因子的刺激而導(dǎo)致的增殖，以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成。Cx在SMC表型轉(zhuǎn)換中可能起了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)收縮型SMC向合成型SMC轉(zhuǎn)換中有更多的縫隙連接，同時(shí)細(xì)胞中Cx43表達(dá)上調(diào)〔13〕。為進(jìn)一步說(shuō)明以上問(wèn)題本文采用體外培養(yǎng)冠狀動(dòng)脈SMC，模擬體內(nèi)動(dòng)脈硬化過(guò)程觀察細(xì)胞表型變化與蛋白表達(dá)關(guān)系，從而闡明再狹窄過(guò)程。正常冠狀動(dòng)脈血管中層SMC有S-SMC和R-SMC，與S-SMC相比，R-SMC具有較高的增殖、遷移和合成、分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)的能力，但分化能力較差〔14〕。本研究結(jié)果與以往報(bào)道結(jié)果一致〔8〕。

SMC之間通過(guò)Cx參與相鄰細(xì)胞間的物質(zhì)和信息交換〔15〕。連接蛋白在哺乳動(dòng)物組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，SMC中主要表達(dá)Cx43、Cx37、Cx40和Cx45〔16〕。Cx43在動(dòng)脈粥樣斑塊形成中可見(jiàn)較高的表達(dá)〔7,17〕，而降低Cx43表達(dá)可以限制小鼠動(dòng)脈粥樣硬化和斑塊的發(fā)展〔18〕。研究〔19〕報(bào)道給予Cx43+/-LDLR-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)14 w后，與Cx43+/+LDLR-/-小鼠相比，其動(dòng)脈粥樣硬化斑塊減小，而且斑塊中出現(xiàn)較少的炎癥細(xì)胞和帶有更多膠原蛋白和SMC的厚纖維帽，提示限制Cx43表達(dá)不僅可以減少斑塊面積，而是可以穩(wěn)定斑塊，后者可能與Cs43抑制巨噬細(xì)胞活性有關(guān)。在小鼠頸動(dòng)脈球囊擴(kuò)張損傷的動(dòng)物模型中，與Cx43+/+LDLR-/-小鼠相比，Cx43+/-LDLR-/-小鼠血管炎性反應(yīng)減輕，并且可以降低SMC增殖與遷移〔20〕。

然而，Cx43在動(dòng)脈粥樣硬化中具體機(jī)制仍不清楚。以往研究認(rèn)為，VSMC表型轉(zhuǎn)換可能與氧化型低密度脂蛋白中的氧化磷脂成分POVPC和PGPC有關(guān)。POVPC降低Cx43的表達(dá)水平，但增加了其絲氨酸279/282磷酸化，導(dǎo)致SMC增殖；然而PGPC增加了Cx43絲氨酸368磷酸化，但并沒(méi)有促進(jìn)SMC的進(jìn)一步增殖〔6〕。Johnstone等〔21〕的研究發(fā)現(xiàn)PDGF通過(guò)Cx43的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化促進(jìn)血管SMC增殖，而在血管損傷后Cx43的MAPK磷酸化可以顯著增加新生血管形成。但其作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

綜上，PDGF-BB誘導(dǎo)SMC由S-SMC向R-SMC轉(zhuǎn)換，伴有Cx43表達(dá)升高，細(xì)胞增殖，而阻斷Cx43表達(dá)后SMC向S-SMC轉(zhuǎn)換，抑制細(xì)胞增殖，但其具體作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究，通過(guò)本研究為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化及PCI術(shù)后再狹窄的防治提供新的理論基礎(chǔ)。

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