代慶春 韓 玉 苗曉云 周曉紅 沈洪麗 張曉衛(wèi)

(滄州市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河北 滄州 061001)

脂多糖(LPS)所致急性肺損傷(ALI)的基礎(chǔ)是全身性炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)，而SIRS的本質(zhì)則是失控的或過(guò)度的炎性反應(yīng)〔1，2〕，且SIRS在ALI發(fā)展為成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)的過(guò)程中也起著至關(guān)重要的作用。目前認(rèn)為炎癥失控是ALI形成的重要原因，而前炎癥因子被過(guò)度產(chǎn)生，抗炎因子相對(duì)或絕對(duì)產(chǎn)生不足則是造成炎癥失控的根本，也就是所謂的炎癥失衡。如何重建促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)間的平衡，已成為阻斷炎癥介質(zhì)的瀑布式反應(yīng)的關(guān)鍵。顧儉勇〔3〕已證實(shí)，在LPS致大鼠ALI后血漿中腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-4的改變。前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)硫化氫(H2S)對(duì)LPS所致ALI具有對(duì)抗LPS所致的肺損傷保護(hù)細(xì)胞的作用。然而H2S的保護(hù)作用與細(xì)胞因子的相關(guān)性尚不十分清楚。本文探討H2S在LPS所致ALI中的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠210只，購(gòu)買(mǎi)后實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1 d，使動(dòng)物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2方法

1.2.1主要試劑 大腸桿菌脂多糖(LPS E.coli O111:B4)、(NaHS)、炔丙基甘氨酸(PPG)均購(gòu)置于美國(guó)Sigma公司；大鼠TNF-α、IL-6、IL-4 ELISA-kit試劑盒購(gòu)置于法國(guó)Diaclone公司。

1.2.2動(dòng)物模型復(fù)制、分組及標(biāo)本制備 大鼠經(jīng)乙醚吸入麻醉，仰臥位固定。無(wú)菌條件下在頸前正中做長(zhǎng)約0.5 cm的切口暴露氣管，以7號(hào)無(wú)菌針頭刺入氣管，在大鼠豎直位下緩慢滴注藥物。滴注以后縫合切口。動(dòng)物清醒之后，自由活動(dòng)，禁食，未禁水。將112只大鼠隨機(jī)分為四組，每組28只，分別取7只于給藥2、4、6、8 h后進(jìn)行觀察。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前的30 min，給大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，經(jīng)舌靜脈注入肝素(1 250 U/kg)抗凝，頸部正中切口，頸總動(dòng)脈插管后放血，留取血漿-80℃保存待分析；同時(shí)留取右肺中葉，用以制備肺組織勻漿。對(duì)照組：氣管內(nèi)滴注無(wú)熱原生理鹽水(200 μl)；LPS組：氣管內(nèi)滴注LPS(200 μg/200 μl)；LPS+NaHS組：氣管內(nèi)滴注LPS前15 min經(jīng)腹腔注射0.5 ml NaHS(28 μmol/kg)；LPS+PPG組：氣管內(nèi)滴注LPS前15 min經(jīng)腹腔注射0.5 ml PPG(45 μmol/kg)。

1.2.3血漿中細(xì)胞因子含量 取-80℃保存的血漿應(yīng)用細(xì)胞因子ELISA法，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定各組給藥2、4、6、8 h后血漿中TNF-α、IL-6、IL-4濃度。

1.2.4組織勻漿中細(xì)胞因子含量 凍存的組織標(biāo)本稱(chēng)重后置于勻漿緩沖液中(4℃)，每毫升緩沖液100 mg組織。緩沖液中含蛋白酶抑制劑的混合物，即1 mmol/L PMSF、1 mg/L 胃蛋白酶抑制劑 A、1 mg/L抑肽酶、1 mg/L 亮抑肽酶溶于含5 g/L Triton X-100的PBS中(pH 7.2)。標(biāo)本勻漿后以18 000 r/min離心。使用上述ELISA試劑盒分析組織上清液中TNF-α、IL-6及IL-4濃度。

2 結(jié) 果

2.1H2S對(duì)LPS所致ALI大鼠血漿TNF-α、IL-6、IL-4水平的影響 對(duì)照組大鼠血漿TNF-α、IL-4的濃度低于檢測(cè)的下限。各組大鼠血漿中細(xì)胞因子的濃度隨LPS的刺激而升高，TNF-α、IL-6及IL-4的濃度于滴注LPS后2 h、4 h、6 h達(dá)到高峰。LPS+PPG組大鼠血漿TNF-α、IL-6及IL-4的濃度達(dá)高峰時(shí)間點(diǎn)為L(zhǎng)PS滴注后2 h、4 h、8 h； LPS+NaHS組大鼠血漿TNF-α、IL-6及IL-4的濃度達(dá)高峰時(shí)間點(diǎn)為L(zhǎng)PS滴注后2、4、4 h。與對(duì)照組相比，LPS組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的血漿TNF-α、IL-6、IL-4濃度均升高。與LPS組相比， LPS+PPG組大鼠于各時(shí)間點(diǎn)上血漿TNF-α、IL-6濃度更高，但血漿IL-4濃度在LPS滴注后2、4、6 h下降，8 h升高； LPS+NaHS組大鼠各觀察時(shí)間點(diǎn)的血漿TNF-α、IL-6濃度降低，但血漿IL-4濃度在LPS滴注后2、4 h升高，6、8 h下降(P均<0.01)。見(jiàn)表1～表3。

表1 滴注后不同時(shí)段大鼠血漿中TNF-α含量的變化

表2 滴注后不同時(shí)段大鼠血漿中IL-6含量的變化

表3 滴注后不同時(shí)段大鼠血漿中IL-4含量的變化

2.2H2S對(duì)LPS所致ALI大鼠肺組織中TNF-α、IL-6、IL-4水平的影響 各組大鼠肺組織中細(xì)胞因子的濃度隨LPS的刺激而升高，TNF-α、IL-6及IL-4的濃度分別于LPS滴注后2、4、6 h達(dá)到高峰。和對(duì)照組相比，LPS組大鼠各觀察時(shí)間點(diǎn)血漿的TNF-α、IL-6、IL-4濃度都升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與LPS組相比，LPS+PPG組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血漿TNF-α、IL-6濃度更高，但血漿IL-4濃度在LPS滴注后2、4、6 h下降，8 h升高； LPS+NaHS組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的血漿TNF-α、IL-6濃度都有降低，但血漿IL-4濃度在滴注LPS后2、4 h升高，6 h、8 h下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見(jiàn)表4～表6。

表4 滴注后不同時(shí)段大鼠肺組織TNF-α含量的變化

表5 滴注后不同時(shí)段大鼠肺組織IL-6含量的變化

表6 滴注后不同時(shí)段大鼠肺組織IL-4含量的變化

3 討 論

近幾年研究提示ALI的發(fā)生不再局限于單純的肺部疾病，而是一種廣義的，是一種全身系統(tǒng)炎性疾病的肺部臨床表現(xiàn)，即多種病因(包括肺內(nèi)或肺外，感染或非感染)都能直接或間接地引起ALI及ARDS〔1，2〕，隨著疾病的進(jìn)展勢(shì)必會(huì)有更多的炎性細(xì)胞被激活，并釋放更多的炎性介質(zhì)或細(xì)胞因子，損害信號(hào)將進(jìn)一步放大和加強(qiáng)，形成炎癥瀑布效應(yīng)。肺部多種炎性細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞PMN、肺泡巨噬細(xì)胞AM等)所介導(dǎo)的肺部炎性反應(yīng)及失控的炎性反應(yīng)是造成ALI的根本原因〔3〕。臨床上造成ALI的原因中細(xì)菌內(nèi)毒素是主要病因，其中又以革蘭陰性細(xì)菌內(nèi)毒素為主導(dǎo)，而其內(nèi)毒素的主要活性成分為脂多糖。LPS所致ALI的本質(zhì)是造成肺部的嚴(yán)重炎性反應(yīng)及炎性損傷，其過(guò)程中不僅有炎癥介質(zhì)的過(guò)度釋放，而且還伴有內(nèi)源性抗炎介質(zhì)的異常釋放。有多種細(xì)胞因子參與了此過(guò)程。在損傷早期，主要參與的炎癥因子有TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等。同時(shí)在炎癥反應(yīng)發(fā)展的過(guò)程中，機(jī)體還會(huì)分泌抗炎性細(xì)胞因子來(lái)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定〔4，5〕， IL-4、IL-10、IL-13即是重要的抗炎細(xì)胞因子，促炎因子和抗炎因子常處在平衡/失衡不斷變化之中。

T淋巴細(xì)胞在調(diào)節(jié)疾病進(jìn)展方面有著重要的作用，其中輔助性T細(xì)胞(Th)的作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。根據(jù)Th亞群的不同，將Th分泌的細(xì)胞因子分為T(mén)h1型和Th2型，兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)機(jī)體是十分重要的。而兩者的標(biāo)志性細(xì)胞又分別為T(mén)NF-α與IL-4，所以調(diào)控兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡也很重要。

小劑量TNF-α能參與自身防御，增強(qiáng)PMN的吞噬功能，促進(jìn)SOD活性，使炎癥局部化，提高存活率；但ALI時(shí)過(guò)度產(chǎn)生的TNF-α則對(duì)機(jī)體產(chǎn)生了較大的傷害，因此其被認(rèn)為是ALI時(shí)炎癥介質(zhì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)因子〔6〕。它可以加強(qiáng)PMN的趨化并在肺內(nèi)聚集，從而激活單核/巨噬細(xì)胞、PMN等釋放更多的炎癥介質(zhì)；隨后內(nèi)皮被激活，PMN的黏附作用加強(qiáng)了，肺微血管通透性也增加了，肺順應(yīng)性相應(yīng)降低，最終導(dǎo)致了ALI〔7，8〕。相關(guān)研究認(rèn)為，細(xì)胞因子TNF-α在過(guò)度炎癥反應(yīng)中起重要的作用。

IL-6是一種具有多潛能的細(xì)胞因子。不僅能對(duì)組織直接造成傷害，還能增強(qiáng)組織細(xì)胞對(duì)TNF-α的敏感性〔9〕。而且在SIRS反應(yīng)中，LPS不僅可直接誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IL-6，同時(shí)在TNF-α誘導(dǎo)下機(jī)體會(huì)產(chǎn)生IL-1β；而IL-1β又可刺激IL-6的生成。由此我們可以看出，IL-6在SIRS病理生理發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中起著重要的作用〔10～14〕。

IL-4是由單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞產(chǎn)生并釋放的，因其能抑制LPS誘導(dǎo)前炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，所以被歸為抗炎細(xì)胞因子，但實(shí)際上它是多效性的細(xì)胞因子。它也可以被TNF-α誘導(dǎo)合成，只是與IL-6的途徑不同而已。

本研究提示了TNF-α可經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6的可能，內(nèi)源性H2S生成減少可能是前炎性細(xì)胞因子增多的原因之一，外源性H2S可以抑制LPS所致ALI大鼠血漿和肺組織中TNF-α、IL-6濃度水平的升高，說(shuō)明在LPS所致的ALI中，H2S保護(hù)細(xì)胞的機(jī)制之一，就是能夠抑制促炎因子的增加，從而減輕機(jī)體過(guò)度的炎癥反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，IL-4也參與了LPS所致ALI的炎癥反應(yīng)過(guò)程，并且可以看出抗炎反應(yīng)要晚于促炎反應(yīng)。這提示在炎癥早期主要是促炎因子的大量釋放,是機(jī)體為了抵御內(nèi)毒素的入侵，將炎癥反應(yīng)擴(kuò)大化的一個(gè)過(guò)程，但隨著促炎信號(hào)的不斷放大，機(jī)體又為了避免其對(duì)機(jī)體造成過(guò)大的傷害并對(duì)機(jī)體進(jìn)行修復(fù)，則會(huì)不斷產(chǎn)生抗炎因子并抑制促炎因子的釋放，來(lái)維持促炎/抗炎之間的動(dòng)態(tài)平衡，使炎癥局限化并好轉(zhuǎn)。在早期多種炎性細(xì)胞的激活和一系列炎性介質(zhì)的釋放，雖然會(huì)對(duì)機(jī)體造成一定的損傷，但總體來(lái)說(shuō)是有益的。但如過(guò)度的反應(yīng)，就會(huì)形成炎癥瀑布效應(yīng)，對(duì)機(jī)體造成致命性的打擊。而抗炎介質(zhì)也是一樣，在炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，其使之趨于局限化，對(duì)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，避免過(guò)度的炎性損傷是有利的。但如果抗炎介質(zhì)過(guò)量，就會(huì)造成機(jī)體免疫功能低下而使其易感性增加。所以維持促炎/抗炎之間的動(dòng)態(tài)平衡，能夠恰當(dāng)?shù)匕l(fā)揮其作用將是研究的主題。

本研究不僅發(fā)現(xiàn)了IL-4參與了LPS所致ALI的炎癥反應(yīng)過(guò)程，還證明H2S是通過(guò)促進(jìn)抗炎因子的表達(dá)并使其釋放高峰提前來(lái)對(duì)抗LPS所致ALI，可以看出H2S對(duì)炎性因子有著較大的影響，其不僅能夠抑制促炎因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，而且還可以促進(jìn)抗炎因子IL-4的表達(dá)并使其釋放高峰提前來(lái)減輕機(jī)體過(guò)度的炎癥反應(yīng)，從而對(duì)抗LPS所致ALI。

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