孔渝菡 秦新月 馮金洲 陶 濤

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院康復醫(yī)學科，重慶 400016)

缺血再灌注過程往往加重組織細胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞，產(chǎn)生再灌注損傷并產(chǎn)生級聯(lián)效應釋放大量神經(jīng)抑制因子，阻礙腦損傷后神經(jīng)的修復。缺血后處理(IPC)是減少腦缺血損傷的一種重要內(nèi)源性保護性措施，但其保護機制仍待進一步研究〔1〕。排斥導向分子A(RGMa)是近年發(fā)現(xiàn)神經(jīng)再生的排斥性導向分子，本研究觀察IPC對局灶性缺血再灌注大鼠RGMa表達以及軸突損傷的影響。

1 材料與方法

1.1實驗分組及缺血后處理 成年SD大鼠50只，體重250～280 g，雌雄各半，購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。實驗過程中動物飼養(yǎng)及取材均遵守實驗動物管理和保護的有關(guān)規(guī)定。動物隨機分為為假手術(shù)組、缺血/再灌注組、缺血后處理組，分兩個時間點，各組5只。大鼠腹腔注射3.5 %水合氯醛(1 ml/100 g)麻醉，假手術(shù)組為分離并結(jié)扎大鼠右側(cè)頸外動脈；缺血/再灌注組參照Longa等〔2〕報道使用線栓法制作大鼠右大腦中動脈缺血模型，缺血2 h后將栓線移出大腦動脈環(huán)開始再灌注。缺血后處理為缺血/再灌注后再灌注起始時立即進行雙側(cè)頸總動脈夾閉10 s，恢復血流10 s，如此反復6次夾閉/再通的過程。

1.2大鼠神經(jīng)功能缺損評分 參照Longa等〔2〕評分標準，根據(jù)無、輕度、中度、中重度、重度神經(jīng)功能缺失及缺血癥狀加重，分別評為0～4分。

1.3大鼠腦梗死容積測量 大鼠腦缺血/再灌注2 d后，過度麻醉并處死取腦，做2 mm連續(xù)冠狀切片5 片，將腦片置于TTC溶液37 ℃避光孵育30 min。拍照并用Image-Pro Plus(IPP)6.0 計算腦梗死容積?？傮w積=各平面面積總和×2 mm厚度，梗死體積百分率= (正常側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)非梗死區(qū)腦組織體積)/正常側(cè)大腦半球體積×100%。

1.4RT-PCR檢測RGMa mRNA表達 從GenBank中找出并根據(jù)RGMa和β-actin基因序列設(shè)計引物送重慶升博生物技術(shù)公司合成。RGMa上、下游引物分別為5′-GCTGGATGGATGGGTATGGG-3′和5′-GCCGCAGTGAGTGTAGTTGG-3′，擴增片段長度456 bp；β-actin上、下游引物分別為5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′和5′-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3′，長度229 bp。取于液氮冷凍。各取100 g右側(cè)大腦中動脈供血區(qū)皮質(zhì)、海馬提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應，將擴增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果并照相，Quantity One軟件進行定量分析，以RGMa與β-actin條帶平均光密度比值表示目的基因mRNA的相對表達量。RNA提取液Trizol及RT-PCR反應試劑盒(大連寶生物工程有限公司)、PCR儀及ChemiDoc xRS凝膠掃描成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.5免疫組織化學檢測RGMa及軸突神經(jīng)絲蛋白(NF)-200蛋白表達 大鼠麻醉、灌注后取腦，放入4%PFA中固定，24 h后做石蠟包埋，制作石蠟切片(片厚4 μm)。用二甲苯和梯度酒精脫蠟，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min，枸櫞酸緩沖液熱修復抗原6 min×4次，1% TritonX細胞通透20 min，山羊血清封閉30 min，RGMa兔多克隆抗體(1∶50，英國Abcam公司)及小鼠抗NF-200一抗(1∶100，武漢博士德生物技術(shù)有限公司)孵育并于4℃過夜。再用生物素標記的山羊抗兔IgG/山羊抗小鼠IgG孵育，辣根酶標記的鏈霉卵白素孵育30 min， 二抗試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)。最后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、梯度脫水及封片。

2 結(jié) 果

2.1各組各時間點大鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死體積 與缺血/再灌注組相比，缺血后處理組大鼠12、24 h、2 d的神經(jīng)功能缺失癥狀明顯減少(P<0.05)。見表1。缺血后處理組腦梗死體積百分數(shù)〔(16.38±3.68)%〕較缺血/再灌注組〔(33.14±6.15)%〕降低(P<0.01)。

2.2各組各時間點大鼠皮質(zhì)及海馬RGMa mRNA表達 后處理組缺血側(cè)皮質(zhì)及海馬RGMa mRNA表達比缺血/再灌注組明顯降低(P<0.01)，1 w后差異仍顯著(P<0.05)。見圖1，表2。

2.3各組各時間點大鼠腦皮質(zhì)及海馬RGMa蛋白表達 免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)RGMa在正常腦皮質(zhì)及海馬均有少量表達，而缺血/再灌注2 d后陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，但缺血后處理組與缺血/再灌注組比較RGMa表達減少(P<0.01)。軸突NF-200染色發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注組2 d缺血側(cè)皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元軸突表達明顯減少(P<0.01)，缺血部分區(qū)域的軸突破壞明顯，軸突排列紊亂，纖維數(shù)目較假手術(shù)組顯著減少，著色變淺，纖維變短變細。缺血后處理組與相應時間點缺血/再灌注組比較顯示，前者NF-200表達均有增加(P<0.01)。見圖2，圖3，表3，表4。

M:標記物；1:空白對照；2:假手術(shù)組；3:缺血再灌注組；4:缺血后處理組

表1 各組大鼠神經(jīng)功能的評分

圖2 大鼠腦缺血/再灌注48 h時RGMa蛋白表達(免疫組織化學染色，×400)

圖3 大鼠腦缺血/再灌注48 h時NF-200蛋白表達(免疫組織化學染色，×200)

表2 各組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)及海馬RGMa mRNA表達

表3 各組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)及海馬RGMa光密度值

表4 各組大鼠缺血側(cè)軸突NF-200的平均光密度變化

3 討 論

IPC是近年發(fā)現(xiàn)的通過誘導靶器官缺血耐受從而減少缺血損傷，實現(xiàn)功能保護的強有效內(nèi)源性保護措施。 其良好的保護作用已在心、腦、腎、消化系統(tǒng)等多種重要器官的缺血性損傷中得到證實〔1，3〕。體外缺血模型實驗對皮質(zhì)神經(jīng)元進行反復多次糖氧剝奪的后處理相比單純糖氧剝奪的對照組損傷減少〔4〕。本研究的前期工作也發(fā)現(xiàn)缺血后處理能夠明顯減少缺血再灌注后大鼠腦內(nèi)的炎癥介質(zhì)釋放〔5〕，進一步證實了這一方法的有效性。本實驗采用線栓法制作大腦中動脈梗死模型，并對實驗大鼠進行再灌注，更接近臨床常見的缺血性腦卒中類型。后處理方式選取了快速后處理，通過6次×10 s/次的近端后處理，大鼠腦梗體積平均減少50.57%，提示了早期近端后處理保護缺血組織的有效性。

盡管已經(jīng)有研究表明，缺血預處理與IPC的器官保護分子機制類似，可能通過Akt、MAPK、PKC通路，KATP通道開放〔6，7〕實現(xiàn)，但其具體作用機制仍有待明確。RGM家族是一種被糖基磷脂酰肌醇錨定的細胞-膜相關(guān)蛋白，編碼產(chǎn)生RGMa、RGMb、RGMc 3種蛋白，其中RGMa和RGMb存在于神經(jīng)系統(tǒng)，而RGMa主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)控軸突生長的排斥作用，它與其他已知軸突導向分子沒有序列同源性〔8，9〕。RGMa與受體Neogenin結(jié)合后激發(fā)Rho A、Rho激酶、PKC活化，導致生長錐塌陷〔10，11〕。本研究結(jié)果提示其作為一種軸突生長導向的分子在缺血的過程中被活化而可能參與缺血再灌注損傷后神經(jīng)修復過程，在IPC組，RGMa的表達在缺血48 h及7 d均較缺血組減少，軸突數(shù)量和NF-200表達較缺血/再灌注組明顯增多，形態(tài)更完整，說明RGMa在缺血再灌注損傷過程中成為軸突生長的阻礙因素，而IPC起到軸突保護作用。

本研究表明，在腦缺血再灌注起始時進行短暫、多次的缺血和再灌注后處理能夠有效減少大鼠腦梗死體積，使神經(jīng)功能缺損改善，減輕軸突損傷與促進恢復，其腦保護機制可能與抑制RGMa/neogenin信號通路激活有關(guān)，從而為IPC的器官保護機制研究提供了一條新的途徑。

4 參考文獻

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